ヒラメにおける完全な全雌生産技術の開発

Research Project

Project/Area Number	21K05740
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 40030:Aquatic bioproduction science-related
Research Institution	Fisheries Research and Education Agency
Principal Investigator	山口寿哉国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 主任研究員 (70604312)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	北野健熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 教授 (40336219)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	ヒラメ / 全雌生産技術 / 性分化 / 環境依存的性決定 / ゲノム編集
Outline of Research at the Start	本研究では、ヒラメにおける完全な全雌生産技術の開発を目的とする。陸上養殖対象魚種であるヒラメは雄よりも雌の成長が早いことから、雌だけを作る全雌生産技術が要望されているが、ヒラメの遺伝的雌（XX）は高水温等の環境要因により簡単に雄化する為、完全な全雌生産が難しいのが現状である。そこで、F0世代で高効率にノックアウト（KO）変異体を作出可能なゲノム編集手法（CRISPR/CASシステム）を用いてヒラメの雄化誘導因子のKO変異体を作出し、環境要因により雄化しない全雌化ヒラメ系統を作出する。
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、環境要因により雄化しない完全な全雌生産を可能にするヒラメ系統をゲノム編集により作出することを目的としている。これまでの研究において、2021年度はCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集によりF0世代から高効率にノックアウト変異体を作出可能であることを確認した。また、ヒラメの性決定遺伝子であるamhの受容体（amhr2）のゲノム編集を実施し、作出したノックアウト変異体の遺伝的雄は卵巣を持つ雌へと性転換することを確認した。これらの結果を踏まえて2022年度はamhr2変異体ヒラメの性転換メカニズムについて調べた。先ずは性分化関連遺伝子の発現状況をリアルタイムPCRにより調べた結果、雄特異的に発現するamhがamhr2ノックアウトヒラメでは発現がほとんど認められなかった。その一方、通常の雌と同様にエストロゲン合成酵素であるcyp19a1及びその転写因子foxl2が高く発現していることが分かった。また、エストロゲン合成酵素の阻害剤であるファドロゾールを投与したamhr2ノックアウトヒラメは卵巣を持つ雌から精巣を持つ雄に性転換していた。これらの結果から、amhr2をノックアウトすることで結果的にエストロゲン合成が阻害されることにより遺伝的雄が雌へと性転換していることが示された。また、ファドロゾール投与実験により全て雌になるamhr2ノックアウトヒラメを雄化させることに成功したことから、系統化に向けてF0のamhr2ノックアウトヒラメ雌雄の交配が可能になった。さらに、ヒラメの性分化機構に関わる新規遺伝子の探索のためにRNA-seqによる性分化開始時期（孵化後５０日）の生殖腺における発現量に雌雄差がある遺伝子の探索を試みた。データ解析の結果、数十個の有意差がある遺伝子を見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2022年度はヒラメにおいてamhr2を介したamhシグナルが性分化の初期に生殖腺の雄化を誘導する重要な役割を持つことを確認できた。このことから、amhr2をノックアウトしたヒラメは高水温などの環境要因により雄化しない可能性が高いと考えられる。また、全て雌になるamhr2ノックアウト変異体をF0で雌雄交配する為にエストロゲン合成酵素の阻害剤投与により雄化することに成功したことから、系統化についても進展した。このように、環境要因により雄化しない完全な全雌生産を可能にする系統の開発にむけて本研究は順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	2023年度は研究計画に従い、変異体が高水温による雄化を引き起こさないことを確認するための高水温飼育実験を実施する。これにより、作出した変異体が全雌生産に有用な系統となり得るかどうかを確認する。また、RNA-seq解析で得られた性分化に関わる可能性がある遺伝子についての発現解析を行い、ゲノム編集による遺伝子機能の解析を行う。