| Project/Area Number |
21K05770
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 40040:Aquatic life science-related
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
木谷 洋一郎 金沢大学, 環日本海域環境研究センター, 助教 (70565340)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
亀井 宏泰 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (00610362)
長島 裕二 新潟食料農業大学, 食料産業学科, 教授 (40180484)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2021: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
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| Keywords | 魚類自然免疫 / L-アミノ酸オキシダーゼ / 抗菌タンパク質 / 魚類 / 過酸化水素 / ROSシグナル / ゼブラフィッシュ / 生体防御物質 / 自然免疫 / ROSシグナリング |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では魚類LAOの新しい機能について言及するため、次の3点について検討する。はじめに、微弱なLAO活性を検出するために高感度LAO活性測定法を開発する。次にLAOが生じた過酸化水素の標的となりうる分子について量的変化をとらえる。最後にLAO-KO魚を作出し、これを用いて健康および細菌感染した状態におけるLAO活性、過酸化水素標的分子の変化そして免疫系の状態について野生型魚と比較する。これらの結果を俯瞰することでLAOを起点としたROSシグナリングが魚類の免疫系に与える影響を評価する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度においてはL-アミノ酸オキシダーゼとその関連遺伝子の生体防御に関わる役割を推定するために野生型ゼブラフィッシュに対して魚病細菌エドワジェラ・タルダ暴露実験を行った。ゼブラフィッシュ飼育水槽に前述の供試菌を懸濁させ，12時間および48時間飼育後に鰓を採取した。鰓からトータルRNAを抽出しこれを逆転写酵素によりcDNAとした。鋳型cDNAについてゼブラフィッシュゲノム情報から設計したゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼ特異的プライマーを用いて定量PCRを行った。しかしながらL-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子について有為な発現量変化は観察されなかった。また，前年度までに開発した蛍光HPLCを用いた高感度L-アミノ酸オキシダーゼ活性測定法を利用して野生型ゼブラフィッシュ鰓抽出液における当該酵素活性測定を行ったがこれは検出されなかった。以上の結果から，ゼブラフィッシュ鰓においてはL-アミノ酸オキシダーゼは遺伝子としては発現しているものの，魚病細菌暴露による変化はなく，また通常状態でもその活性は非常に低いことが予想された。
また，無細胞発現系によるリコンビナントゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼの作製を試み，これは前年度に作製したゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼ抗体と反応することを確認した。
これに加えて，ゲノム編集技術を用いたL-アミノ酸オキシダーゼノックアウトゼブラフィッシュの創出を引き続き試みており，L-アミノ酸オキシダーゼの欠損が生体防御や発生にどのように関与するか明らかとする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該年度ではゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼの遺伝子発現が魚病菌暴露で誘導されず，そのL-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子，L-アミノ酸オキシダーゼタンパク質およびその酵素活性を検出することができなかった。現在，種々の化学物質等を使用してゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼ誘導条件を探索中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在，ゼブラフィッシュのROSシグナリング関連物質に対する抗体を設計中であり，L-アミノ酸オキシダーゼ誘導条件を確定させたのちにこれらの抗体によるタンパク質の状態変化を二次元電気泳動で可視化し，ROSシグナリングとL-アミノ酸オキシダーゼの関連性を比較する予定である。
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