| Project/Area Number |
21K05894
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42010:Animal production science-related
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
建本 秀樹 琉球大学, 農学部, 教授 (70227114)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | ブタ体外受精 / 透明帯 / sulfatase / 多精子侵入 / 先体反応 / ARSA / 脱硫酸化 / 多精子受精 / エラグ酸 / 抗ヒアルロニダーゼ活性 / ヒアルロニダーゼ / 硫酸化糖鎖 / 精子－透明帯間相互作用 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は，精子SAPM1-ARSA複合体と卵透明帯との相互作用が受精機序に関与している点に着目し，その生理学的作用を制御する手法を介してブタIVF時に高頻度に起こる多精子受精を効果的に抑制することを目的として実施する。さらに，この精子SPAM1-ARSA複合体と透明帯硫酸化糖鎖との相互作用は，全ての哺乳類の受精時にも関与しており，他の哺乳類卵のIVF時の多精子受精抑制にも繋がる重要な研究であると考えられる。さらに，当研究室ではIVF由来胚のガラス化凍結試験も実施しており，体外で正常受精胚を多数作出できるIVF環境を整えることは希少な日本唯一の在来豚であるアグーの種の保存にとっても重要である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度の研究により，精子のSPAM1-ARSA複合体のARSAに着目し，媒精前の卵子に5 mU/mL sulfatase処理を10分間施すことで，ARSAと卵透明帯の硫酸化糖鎖との結合を阻害した場合，多精子侵入率の有意な減少が確認された。そこで，本研究では，ARSA-blocking peptide (ARSA-BP)を使用し，精子側のARSAと透明帯構成糖タンパク質の硫酸化糖鎖への結合を抑制する作用を介して効果的な多精子侵入の抑制が可能か否かを検討した。
IVF後の受精パラメーターでは，5 ng/mL以下のARSA-BP処理では精子侵入率を低下させることなく，多精子侵入率が無処理区(61.0%)より有意に低下した(31.3%)。しかし，透明帯結合精子数がARSA-BP処理で有意に変化することは無かった。したがって，ARSA-BPやsulfatase処理卵の多精子侵入抑制は，先体反応誘起に関わる二次結合に関与していると考えられた。そこで，透明帯へ結合した精子の先体反応精子率を測定したところ，無処理区で31.6%であった値が10分間のsulfatase処理区では23.9%に，5 ng/mLのARSA-BP処理区では20.2%と有意に低下し，ARSAと透明帯硫酸化糖鎖との結合によって惹起される先体反応誘起が多精子侵入に関与していると確認された。次に，sulfatase処理区とARSA-BP処理区の体外発生能を比較した結果，胚盤胞期胚への発生率はARSA-BP処理区で高く，sulfatase処理区と無処理区とでは同値であった。また，TUNEL陽性細胞率はARSA-BP処理区で12.1%と有意に低くなった。
すなわち，精子ARSAと卵透明帯構成糖タンパク質硫酸化残基との相互作用を抑制すると，ブタ卵IVF時の多精子侵入率を低下させることが可能であることが確かめられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ブタに対して繁殖工学技術を有効に活用する上で大きな妨げになっている要因は，ブタは他の動物種に比べてIVF時の多精子侵入が高率な点である。そこで，多精子侵入を効果的に抑制する新しいIVF法を確立することは非常に重要である。
そこで本研究では，精子のSPAM1-ARSA複合体におけるARSAに着目し，IVF培地へのARSA-BPを添加することで，ARSAと卵透明帯の硫酸化糖鎖との結合を低下させ，効果的な多精子侵入の抑制が可能か否かを検討した。これまでの我々の研究により，未成熟ブタ卵の透明帯構成糖タンパク質には多くの酸性化糖鎖末端が存在しており，この糖鎖の酸性化は主に硫酸塩およびシアル酸の修飾によるものである。そして，酸性化糖鎖の割合は卵成熟に伴って増加し，精子侵入率および多精子侵入率，透明帯への結合精子数，さらには透明帯に結合した精子の先体反応誘起率等の透明帯の精子受容能を高める作用に関係していることが明らかになっている。この卵成熟に伴って増加する透明帯構成糖タンパク質の硫酸化糖鎖と精子ARSAとの結合を，IVF時の5 ng/mL ARSA-BP処理により抑制したところ，精子侵入率を低下させることなく，多精子侵入率のみを有意に減少させることに成功した。また，ARSA-BP処理は，透明帯への精子結合数には影響を及ぼさず，透明帯に結合した精子の先体反応誘起を抑制することが確認された。同様な結果は，sulfatase処理卵にも認められ，ARSAと透明帯硫酸化糖鎖末端との相互作用を人為的に操作することでブタIVF時の多精子侵入が抑制できる可能性が確実になった。すなわち，引き続き精子－透明帯間の相互作用に注目した多精子受精抑制法を検討し，効果的かつ安定的なIVF法の実現を目指すことが重要であると考えられ，本研究を遂行するに当たって，研究は順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本実験で最も多精子侵入を抑制できたARSA-BP処理卵でも，その多精子侵入率は20.2%であり，他の哺乳類のIVF時に観察されるような10%程度までの多精子侵入率の減少には至らなかった。そこで，さらに効果的に多精子侵入を抑制するIVF法を確立するためには，SPAM1-ARSAの複合処理を検討する必要性があると考えられる。
ここでARSAがChondroitin Sulfate B (CSB)と特異的に結合しやすい点に着目したい。すなわち，令和3年度，我々は，強い抗ヒアルロニダーゼ作用を有するエラグ酸を利用し，精子ヒアルロニダーゼ活性を阻害することによる多精子受精抑制方法を検討した。その結果，精子ヒアルロニダーゼが精子－透明帯間の相互作用に関与しているとの興味深い結果が得られ，透明帯結合精子の先体反応誘起の抑制により，多精子受精が抑えられることが分かった。ヒアルロニダーゼ活性を有するSPAM1は，先体内に存在する分子シャペロンであるHSPA2を介して，ARSAと複合体を形成していることが，ヒト精子において明らかにされている。受精能を獲得する以前の精子ではSPAM1が先体表面に発現しており，受精能獲得の完了とともにARSAとSPAM1が部分的に反転してARSAが細胞膜表面に発現する。すなわち，SPAM1へのヒアルロニダーゼ阻害活性を通じてSPAM1とARSAの反転に何らかの影響を及ぼした結果，先体反応誘起が抑えられ，多精子侵入が抑制された可能性が推測される。したがって，今後は，SPAM1-ARSA複合体におけるSPAM1のヒアルロニダーゼ活性とARSAが有する透明帯構成糖タンパク質の硫酸化糖鎖末端への結合作用をCSBを用いて同時に制御することで，複合的な作用機序による多精子受精抑制処理を試行する必要があると考える。
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