分子時計によるアクアポリン1発現調節機構の解明と腎障害への関与についての研究

• Project/Area Number: 21K05922
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 園田 紘子 宮崎大学, 農学部, 准教授 (60608272)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: アクアポリン１ / 分子時計 / 腎障害

Outline of Research at the Start

本研究は「腎において分子時計によってアクアポリン１（AQP1）は発現調節を受けており、腎障害では分子時計の破綻によりAQP1の発現量減少が引き起こされる」という作業仮説を明らかにすることを目的とする。具体的には①AQP1は分子時計による発現調節を受けているのかどうか、②腎障害におけるAQP1発現量減少は分子時計の破綻によるものかどうかの二点について明らかにしていく。本研究で得られた成果によって、AQP1の新たな発現調節メカニズムが明らかとなり、また、腎疾患における新たな病態生理学的知見を得ることができる。これらの知見は、新規の腎疾患診断法や腎疾患治療薬の開発研究に寄与するものと考えている。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、「腎において分子時計によってアクアポリン１（AQP1）は発現調節を受けており、腎障害では分子時計の破綻によりAQP1の発現量減少が引き起こされる」という作業仮説を明らかにすることを目的としている。今年度は、明期および暗期において処置を行った両腎虚血再灌流ラット（IRラット）について解析を行った。明期の始まりをZT０とし、12時間の明暗周期で飼育したラットについてZT5～8時（明期IR）およびZT17～20時（暗期IR）にてIR処置を行い、1日毎に採血、8日目に腎摘出を行った。腎機能評価の為に血漿クレアチニン濃度（Cre）を測定したところ、明期IRラットでは2日目をピークに上昇し、その後減少して8日目には対照ラットと同程度であった。一方、暗期IRラットでは3日目をピークに上昇し、8日目においても対照ラットよりも高値を示した。また、ピーク時のCreは明期IRラットと比較して暗期IRラットの方が約2倍高値であった。したがって、明期よりも暗期にIR障害を与えた場合には腎障害の程度が大きく、回復も遅延することが示された。次に、IR処置において障害を受けやすい腎皮質（Cor）および髄質外帯(OM)について、明期および暗期IRラットのIR後8日目のAQP1 mRNA発現量を解析した。明期IRラットではCorではAQP1 mRNA発現量はsham群と同程度で、OMでは有意に減少した。一方暗期IRラットでは両部位で有意に減少しており、その程度も明期IRラットよりも2倍減少していた。これまでの研究成果でAQP1は腎において暗期よりも明期の方が、mRNA発現量が多いことを見出している。AQP1は細胞遊走を促進することで障害からの回復に寄与することが示されていることから、AQP1発現量の多い明期にIR処置を行った方が障害の程度が軽度で、障害からの回復が早いことが考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の予定では今年度はin vitro実験を行う予定であったが、本研究室のin vitro実験室が長雨などの影響でカビによる汚染が起きてしまい使用が困難となったため、遅れてin vivo実験の方に着手したため、やや進捗が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

AQP1が時計遺伝子群による発現調節を直接受けているかどうかについては、当初はin vitro実験のルシフェラーゼアッセイで行う予定であったが、より生体に近い条件で行えるクロマチン免疫沈澱法に変更する。具体的には腎組織サンプルから時計遺伝子群の転写因子であるBmal1などの抗体によって補足されたDNAを抽出し、ラットAQP1遺伝子上流のBmal1標的配列であるE-Box配列付近をターゲットとしたPCRを行う。
in vivo実験では今年度は両腎虚血再灌流（IR）障害後の長期的な観察を行ったが、次年度は障害がピークとなる早期の解析を行う予定である。また最近になって、腎IR障害時の酸化ストレスも概日リズムの影響を受けることが報告された。したがって、腎障害と概日リズムについては複数の要因が関与していることが考えられる。このことを考慮すると、明期および暗期に腎障害を誘発した腎における遺伝子発現解析には、マイクロアレイなどの網羅的解析が必要であることが考えられる。そのため、今後は遺伝子解析については網羅的解析法も加えて行っていく。