Functional analyses of TAF-I in regulation of cellular senescence and SASP gene transcription

• Project/Area Number: 21K06010
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43010:Molecular biology-related
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 加藤 広介 筑波大学, 医学医療系, 助教 (90466673)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 細胞老化 / 加齢性疾患 / がん / SASP / クロマチン / エピジェネティクス

Outline of Research at the Start

本研究課題では、TAF-Iの細胞老化における機能をモデル細胞系で明らかにし、かつ適切な時期での遺伝子欠損を可能とするTAF-IのcKOマウスを作製してTAF-Iのマウス個体における加齢表現型への関与を明らかにすることを目的とする。研究期間の1－3年目初頭までに培養細胞での細胞老化モデル系を用いてTAF-Iによる老化表現型の制御機構、およびSASP遺伝子発現の制御機構の解明を目指す。また並行してTAF-I遺伝子のコンディショナルKOのための遺伝子改変マウスを作製し、特異的組織でのる加齢性表現型におけるTAF-Iの機能を明らかにする。また、本研究成果を3年目までに論文として発表する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、クロマチン制御因子TAF-Iによる細胞老化の制御機構の解明と成体マウスの加齢に伴う表現型におけるTAF-Iの役割の解明を目的とする。令和4年度は、主にTAF-Iによる細胞老化の制御機構について、令和3年度に引き続き培養細胞系を用いた解析を中心に行った。
ヒトの正常繊維芽細胞にHras変異体を発現させて細胞老化を誘導し、細胞表現型の経時的な変化を検証した。その結果、Hras変異体導入後7～10日にTAF-Iの発現量が一過的に増加し、その後13日までにHras変異体導入前と同程度の発現量に戻る様子が観察された。また、Hras変異体の発現と同時にTAF-I遺伝子特異的なshRNAを導入してTAF-Iの発現を抑制し、細胞表現型の経時的な変化を検証したところ、誘導7～10日でTAF-Iの発現抑制により、ヒストンH3やLamin B1の発現量低下が顕著に抑制された。また、細胞老化が誘導されると、ヒストンH3のN末端領域が切断されてH3cs1に変化し、これが老化細胞の遺伝子発現パターン形成に重要であることが知られている。ヒストンH3タンパク質の変化を詳細に解析したところ、TAF-Iの発現抑制によりヒストンH3のH3cs1へのプロセシングが顕著に抑制される様子が観察された。以上の結果より、細胞老化の進行過程でTAF-Iの発現量が一過的に増加し、それがヒストンH3cs1の形成を介した遺伝子発現調節を促すことで、Lamin B1の分解などの老化細胞の表現型を促進する可能性が示唆された。現在、TAF-Iにより発現調節を受ける遺伝子の中で、ヒストンH3cs1形成に関わる候補遺伝子の同定を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和4年度は令和3年度に引き続き、培養細胞系を用いたTAF-Iによる細胞老化の制御機構の解析を中心に実施した。その結果、細胞老化の進行過程でTAF-Iの発現量が一過的に増加し、その下流でヒストンH3のH3cs1タイプへのプロセシングが制御されることを明らかにした。ヒストンH3cs1の形成は細胞老化において重要なプロセスであることから、TAF-Iの細胞老化制御における機能を明らかにする上で、フォーカスすべきポイントをある程度絞り込めたことは大きいと考えている。しかし、今年度に進める予定であったTAF-I遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの作製は、いくつかの技術的な問題から予定通りには進捗できなかった。

Strategy for Future Research Activity

今後は、細胞老化過程でTAF-Iにより発現制御を受ける遺伝子を同定するためにRNA seqなどによる包括的な遺伝子発現解析を行う。その中から、ヒストンH3のプロセシングに関わるプロテアーゼ遺伝子を同定し、TAF-Iによるその遺伝子の転写制御機構をエピジェネティクスマーカーやクロマチン構造のレベルで明らかにする。さらに、ヒストンH3cs1の形成が細胞老化付随ヘテロクロマチン（SAHF)の形成に与える影響を明らかにする。また、TAF-I遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの作製を引き続き進める。培養細胞レベルでの解析結果をまとめて論文投稿を行う。