Measurement of histone modification propagation velocity in a single living cell using CRISPR and BiFC
| Project/Area Number |
21K06020
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
岡田 悟 九州大学, 医学研究院, 助教 (30734488)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 出芽酵母 / CRISPR-Cas / BiFC / イメージング / 褪色 / CRISPR/Cas / ガイドRNA / DNA二本鎖切断 / 蛍光タンパク質 / GFP結合タンパク質 / 生細胞イメージング / ヒストン修飾 |
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| Outline of Research at the Start |
ヒストンの翻訳後修飾は、DNAのメチル化と並んで、エピジェネティック制御の中核をなす分子機構である。その制御機構の動的側面を理解するために、本研究では、CRISPR/Cas9システム、ヒストン修飾認識ドメイン、BiFCを組み合わせて利用することにより、上記の情報要素すべてを同時に取り出すことのできるイメージング手法を確立し、これを用いてヒストン修飾がゲノム上を伝搬していく速度を単一の生細胞で計測する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストンの翻訳後修飾とDNAのメチル化は、エピジェネティック制御における重要な分子機構として位置づけられている。これらの修飾の動態を解明するには、「いつ」「どの細胞で」「どのような修飾が」「細胞核のどの領域で」「ゲノムのどの位置で」生じるかを特定することが必要である。本研究では、CRISPR-Cas系、ヒストン修飾認識ドメイン、およびBiFCの組み合わせを用いて、これらの情報を同時に抽出できるイメージング技術を開発し、この技術を用いて、ヒストン修飾のゲノム上での伝搬速度を単一の生細胞レベルで測定することを目指す。この測定を通じて、個々の細胞間でのヒストン修飾の伝搬速度のばらつき、修飾酵素・リクルート因子・ヒストンリモデラーの変異が単一細胞レベルで伝搬速度にどのような影響を与えるかなど、従来未検証な問いへの答えを得ることを目的とする。
今年度は、昨年度までに開発した、GFP結合タンパク質GFP-clampを用いて蛍光タンパク質の褪色を遅延させる手法をBiFCに対して適用することを試みた。BiFCが観察できる核小体タンパク質ペアNet1-Sir2に対して、GFP-clampを共発現させると、BiFCシグナルの褪色は遅延した。GFP-clampによる蛍光タンパク質の褪色遅延は、BiFCによって再構成された蛍光タンパク質に対しても有効であることが確認された。
また、ゲノムDNAに対する結合効率が高いCRISPR-Cas系を選抜するため、既存のdSpCas9、dSaCas9、denAsCas12aに加えて、自然状態でDNA切断能を持たないCas12cおよびMmCas12mを試用した。mNeonGreenタグを付加したCasタンパク質によるCUP1リピートの可視化を指標とした。これら2種類の非切断性Casを利用したCUP1リピートの可視化は既存の3種類の系よりも低効率であることが分かった。
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Report
(3 results)
Research Products
(29 results)
