| Project/Area Number |
21K06042
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
別所 義隆 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 客員研究員 (70242815)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | DNAフォトリアーゼ / ピリミジン二量体 / 光回復酵素 / XFEL / 時分割結晶構造解析 |
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| Outline of Research at the Start |
DNAフォトリアーゼは、紫外線曝露により生じるDNAピリミジン二量体の損傷を修復する酵素である。この酵素は、その反応に可視スペクトルの紫色や青色の光を必要としており、光回復酵素として知られている。しかし、この光修復反応において酵素と基質DNAの間で起こる分子間反応のダイナミクスは全く捉えられていない。そのため本研究は、DNAフォトリアーゼの修復反応を構造化学的に明らかにするため、Ｘ線自由電子レーザー（XFEL）をプローブ光として使用し、酵素と基質の反応を時間分解で捉えることを目的とする。分光学的手法では観察できない反応中間体を見出し、DNA修復の反応メカニズムを完全に解明することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAフォトリアーゼは、紫外線曝露により生じるDNAピリミジン二量体の損傷を修復する酵素である。その反応には可視の青色光のエネルギーを必要としており、光回復酵素として知られている。この研究では、この酵素の光回復反応において、分子間反応のダイナミクスを構造化学的に明らかにすることを目的とする。我々は、古細菌Methanosarcina mazeiのクラスII-CPDフォトリアーゼ（MmCPDII）をターゲット酵素に選定した。この酵素は、高分解能のＸ線結晶構造が既に報告されており、また分光学的特徴もよく知られているのでこの研究に最適な材料である。昨年度までに、XFEL実験で使用する液体ジェット噴出装置の規格に合うようにMmCPDII単体のマイクロ結晶をを大量に作成することに成功し、SACLAのBL2ビームラインにてXFELを照射することで回折データを取得する方法を確立した。今年度、MmCPDIIの酸化型および還元型結晶構造のモデルを構築し、酸化還元状態によって酵素に内包されるフラビン補酵素のイソアロキサジン環に構造差異があることを見出した。これを受けて、酵素の光還元反応がどうのように進むか時系列を調べる目的で、時分割実験の試料条件を検討し、XFEL測定法をデザインした。また、XFELの生物試料イメージングも高度化するために、高度好熱菌Thermus thermophilusの細胞やタンパク質を追加のターゲットに選定した。XFEL回折から生細胞の低分解能イメージを取得した。今後XFEL測定用の封入チップを結晶に使用できるように再設計する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
古細菌Methanosarcina mazeiのクラスII-CPDフォトリアーゼ（MmCPDII）単体と損傷DNA複合体のマイクロ結晶を効率よく作成する条件を見出した。結晶に混ぜる充填剤を最適化し、SACLA施設にてXFELビーム照射によるＸ線回折データ取得に成功した。単体タンパク質の構造解析の結果、酸化還元状態によって酵素に内包されるフラビン補酵素に差異があることを見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAフォトリアーゼ損傷DNA複合体のマイクロ結晶の作成条件を最適化し、SACLAのXFELビームで構造解析に適した回折データセット取得を目指す。従来のＸ線では分からなかった放射線損傷のない正確な結晶構造を解明し、更には時分割測定により光修復反応のダイナミクスを明らかにする。
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