| Project/Area Number |
21K06058
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
|
|---|
| Research Institution | Asahikawa Medical College |
|---|
Principal Investigator |
山崎 和生 旭川医科大学, 医学部, 講師 (60241428)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
|
|---|
| Keywords | カルシウムポンプ / イオン輸送 / リン脂質 / 熱産生 / 脱共役 / 非ふるえ熱産生 / 酵素反応速度論 / 膜タンパク |
|---|
| Outline of Research at the Start |
恒温動物において、筋肉は運動を司る器官であるとともに、体温維持のための熱発生器官でもあります。筋肉は震えることにより、熱が発生し体温の低下を抑えますが、この震えとは別の機構でも、筋肉が熱発生をやっていることが知られています。しかしそのメカニズムについては良く分かっていませんでした。最近、筋肉にあるカルシウムポンプの働きを調節するタンパク質（サルコリピン）を無くしたマウスは体温維持に異常をきたすという報告があり、筋小胞体のカルシウムポンプが熱産生の鍵であるのでは無いかと考えられるようになってきました。そこで本研究では筋小胞体カルシウムポンプの脱共役について調べ熱産生への寄与を見積もります。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
筋小胞体カルシウムポンプの脱共役モードについて検討する足掛かりとして、ナノディスクに組み込んだカルシウムポンプ標品で見られる、ATP加水分解反応の反応初期におけるリン酸の過剰放出現象について調べた。その溶存ガス依存性や、マグネシウム依存性について検討を加えたが、過剰リン酸放出フェーズの大きさや継続時間は、再現性に乏しく明瞭な結論が得られなかった。
そこで基本に立ち返り現象が現れる温度、測定手法、溶液量などについて今一度詳細に検討してみたところ、実験系の温度管理と攪拌法が、リン酸の過剰放出に重要であることが判明した。そして、得られた結論は測定温度領域における、ATP分解反応が非常に温度依存性が大きいことが原因であり、反応開始のため攪拌した際の温度上昇が過剰リン酸放出を引き起こしていることが分かった。
そこでATP分解活性の温度依存性と律速段階であるリン酸化中間体（EP）の加水分解速度の温度依存性を取ったところ、カルシウムポンプをフォスファチジルコリン（POPC)を含むナノディスクに組み込んだ標品では、0℃付近において二つの間に差があることが分かった。このためこの標品では、0℃ではATP分解活性の実測値とEP量にEP分解速度を掛けた計算値が良く一致したのに対し、温度を少し上げるとこの二つが解離し、実測値の方が計算値より速くなることが見いだされた。これはこの温度領域で非共役モードが現れていることをし増している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
この研究を始めたきっかけは、フォスファチジルコリン（POPC)をもつナノディスクに組み込んだカルシウムポンプで、ATPase反応を測定した時、反応の初期相において、非常に速いリン酸の放出が観察されたことにある。リン酸化中間体の蓄積量とその加水分解速度から見積もることのできるリン酸放出量の3倍に近い速度のリン酸放出は、本来のカルシウム輸送とは関係のない脱共役経路の存在を示すものであり、今まで確立されたPost-Albertモデルと呼ばれるP-type ATPase共通の反応機構とでは説明できないものであった。この経路について詳しく調べる本研究はその再現性、Ca依存性、溶存ガスの影響、ナノディスクに含まれる脂質の影響などのデータを取ることができていたが、その経路の本質は何であるかつかめないでいた。しかし最終年度になり、初期過剰リン酸放出の主たる原因が、ナノディスクに組み込まれたカルシウムポンプのATP分解活性の温度依存性が異常に大きいこと、そしてリン酸化中間体の加水分解とATP分解活性では温度依存性が異なることをあきらかにすることができた。この二点はカルシウムポンプの脱共役経路の解明において真の突破口となる。この新たな知見が得られたことにより、今後この研究を大きく展開できる見通しが立った。この結果が得られたのが遅かったため、3年間の期間内に形のあるものと出来なかったのは残念であるが、残り一年の期間内に最初の目論見をおおきく上回る結果が得られると期待できる。従って進捗状況は（２）おおむね順調に進展していると言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまで得られた結果から、POPCを含むナノディスクに組み込んだカルシウムポンプは、EP分解速度とATP分解活性の温度依存性に乖離が生じ、ある温度帯で脱共役経路が顕著になることが分かった。今後このような乖離がSRV標品や他の種類の脂質を組み込んだナノディスクにカルシウムポンプを組み込んだ場合に起きるか、また起きるとすれば、その規模はどの程度かしらべる。またSR膜に存在するカルシウムポンプの調節因子であるサルコリピンがこの現象にどのような影響を及ぼすか調べてゆく。またリン酸化中間体の分解速度とリン酸化中間体量から見積もったリン酸放出量と、ATP分解活性が解離している状況で実際のカルシウム輸送能はどのようになっているのか分かっていない。ナノディスクに組み込んだ状況ではカルシウム輸送は測定できないので、カルシウムポンプをジャイアントベシクルに再構成して、カルシウム輸送活性を測定することを試みる。
またここまでの解析はSR膜から調製したカルシウムポンプ標品を用いたものであったが、脱共役経路の反応メカニズムについての情報を得るために、触媒部位付近のアミノ酸残基に変異を導入した変異体を作成する。それらの変異体をナノディスクに組み込んでEP分解速度とATP分解活性の温度依存性の解離状態がどのように変化するかについて調べる。この分析から触媒部位付近の構造と脱共役反応との関係を探り、その反応機構を明らかにしてゆきたい。
|
