| Project/Area Number |
21K06079
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
久保 健一 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 助教 (60403359)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 自他識別 / 協調的非自己認識 / S-RNase型自家不和合性 / 花粉生理学 / リボヌクレアーゼ活性 |
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| Outline of Research at the Start |
ナス科植物が自殖を防ぐメカニズム、自家不和合性では、雌ずいがRNA分解酵素、S-RNaseを用い自己花粉管を排除しているが、自己花粉管内のRNA分子が実際どう影響を受けるのか詳細は不明である。そこで、2通りのRNA次世代シーケンス（RNA-seq）解析を行い、ナス科ペチュニアの自家／他家受粉後の花粉管RNA転写物の質的、量的な変化をモニターする：(1) 典型的なpoly(A)-RNAをRNA-seq解析する方法で、mRNA転写物の全体像を捉える。(2) RNA分解中間体の末端化学構造に着目し、自己花粉管特異的なRNA切断イベントを網羅的に特定する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の自殖を防ぐ性質である自家不和合性は、非自己由来の雌ずい因子を複数の花粉因子を用いて認識する「非自己認識」機構に基づいている (Science 2010; Nat.Plants 2015)。この機構では、雌ずい因子S-リボヌクレアーゼ(S-RNase)は、細胞毒として機能し花粉管を排除する。一方、花粉因子S-locus F-boxes (SLFs) は、S-RNaseを認識、解毒することで、非自己花粉の交配和合性を保障するが、自己由来S-RNaseだけは解毒できないので、自己花粉管は排除される。本研究は、この自家不和合性機構における自己花粉管排除の分子機構を明らかにすることを目的としている。
本課題におけるこれまでの研究から、本来自家不和合性植物であるペチュニアの自家和合性変異株の解析により、自家不和合性S遺伝子座に非連鎖の遺伝子PhML1と、S遺伝子座上の遺伝子S-RNaseのそれぞれにおける機能不全が、自家不和合性の打破を引き起こしていることが示唆されていた。昨年度は、それらの変異の原因解明を通じ、自家不和合性が発揮される分子機構の解明を目指している。
PhML1については、その相補性試験による機能証明を行うため、昨年度開発した正常なPhML1を発現するコンストラクトを用い、和合性変異株に対して形質転換実験を行っているところである。
S-RNase遺伝子の機能不全については、その発現が損なわれていることが和合性の原因であると示唆する結果が得られていたが、なぜS-RNase遺伝子が発現しなくなっているのかは判っていなかった。そこで、ロングリードシークエンスデータによりS-RNase遺伝子周辺のゲノム配列を取得し、同遺伝子が発現する自家不和合性株との比較を試みた。しかしながら、両者に大きな違いを見いだすには至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本課題開始時からの懸案であった東京大学から長浜バイオ大学へのサンプルの移管の遅れについて、遅ればせながらようやく受け取り保管態勢が整い、昨年度中に必要なDNA、RNAサンプルの運搬と移管が完了できた状況である。形質転換実験に植物体の輸送とその後の栽培に悪影響が生じており、形質転換効率が著しく低くなってしまったため、形質転換実験の進捗も遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、昨年度入手できたRNAサンプルを用いたデグラドーム解析による被分解RNAの直接解析のための条件検討を行う。より具体的には、被分解RNAの抽出条件、分解産物RNA分子へのタグ配列の付加反応条件を検討した上で、分解産物RNAのライブラリーを調製し、次世代シークエンス解析を行う。また、自家和合性変異株のS-RNase遺伝子の発現が損なわれる原因を特定するため、より深いdepthでのPacBio Sequel-IIによる全ゲノムDNAのロングリードシークエンス解析を行う。また、エピジェネティックな変異が関与する可能性を検証するため、新たにメチル化DNAの検出実験も行う。
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