The interrelationship between oligomer formation, DNA unwinding, and ATPase of a helicase studied using mutants lacking its C-terminal amino acids
| Project/Area Number |
21K06103
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries |
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Principal Investigator |
横田 浩章 光産業創成大学院大学, 光産業創成研究科, 准教授 (90415547)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | １分子計測 / ナノバイオ / 核酸 / 酵素反応 / 1分子計測 / ヘリカーゼ |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質の多量体形成は、活性制御などに重要な役割を果たす。研究代表者は非六量体型スーパーファミリー1ヘリカーゼUvrD のC末端アミノ酸欠失変異体が、野生型に比べて多量体を形成しづらいことを明らかにした。一方、その多量体構造は報告されておらず、多量体を構成する個々のUvrDがどのような相互作用を経て、ATP加水分解エネルギーを使いDNA巻き戻しをしているのかは不明である。
そこで本研究では、UvrDのDNA巻き戻し機能に関わる多量体形成に重要なC末端アミノ酸に注目し、UvrDの多量体構造・DNA巻き戻し機能・ATPの結合解離（ATPase）の相関関係を蛍光1分子イメージングで明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くのタンパク質で見られる多量体形成は、タンパク質の活性制御などに重要な役割を果たす。研究代表者は非六量体型スーパーファミリー1ヘリカーゼUvrD のC末端アミノ酸欠失変異体が、野生型に比べて多量体を形成しづらいことを明らかにした。一方、その多量体構造は報告されておらず、多量体を構成する個々のUvrDがどのような相互作用を経て、ATP加水分解エネルギーを使いDNA巻き戻しをしているのかは不明である。
そこで本研究ではUvrDのDNA巻き戻し機能に関わる多量体形成に重要なC末端アミノ酸に注目し、UvrDの多量体構造・DNA巻き戻し機能・ATPの結合解離（ATPase）の相関関係を蛍光1分子イメージングで明らかにする。そしてこれまで明らかにするのが困難だったタンパク質の多量体形成とそれによる機能発現の間のブラックボックスに迫ることを目指している。
研究代表者は、多量体を形成できないとされるC末端40アミノ酸欠損変異体（UvrDΔ40C）が定説に反し、二量体あるいは三量体でDNAを巻き戻していることを明らかにしている（Biophysical Journal (2020)、生物物理 (2021)、Biophysics and Physicobiology (2022)）。
2023年度は、UvrD のC末端アミノ酸の多量体形成への役割をさらに理解するために、ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し中のUvrDのDNA上の滞留時間の解析を行った。また、ビオチン標識したUvrD C末端アミノ酸欠失変異体を作製したほか、全反射照明蛍光顕微鏡法（TIRF）で用いている試料セルを改変し、ゼロモード導波路による蛍光1分子イメージングでも溶液貫流が可能な試料セルを構築した。そして、ゼロモード導波路による高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージング、UvrD多量体構造の蛍光1分子イメージング、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察に取り組んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し過程の解析により、C末端アミノ酸の多量体形成の役割の理解を深めることができた。一方、溶液貫流を可能にしたゼロモード導波路観察系の構築に時間を要し、高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージング、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察は、やや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し過程の蛍光1分子イメージングの解析とUvrD多量体構造の蛍光1分子イメージングを継続する。また、系の構築のため遅れをとっているゼロモード導波路による高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージングとDNA巻き戻しの1塩基分解能観察については、作製したビオチン標識C末端アミノ酸欠損変異体へ対象を広げながら進める。
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Report
(3 results)
Research Products
(13 results)
