Na+,K+-ATPaseによるK+選択的結合機構の構造生物学的研究
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21K06109
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
金井 隆太 東京大学, 定量生命科学研究所, 特任助教 (50598472)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | Na+,K+-ATPase / 能動輸送 / K+選択性 / 電子顕微鏡単粒子解析 / X線結晶構造解析 / イオン選択性 |
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| Outline of Research at the Start |
Na+,K+-ATPaseのK+選択的結合機構の解明を目指して、K+結合過程の中間体構造を決定する。この過程ではK+結合とともに細胞外側ゲートが閉じること、脱燐酸化反応の開始の2つのイベントが連動している。10年以上前にK+結合状態の1つ(E2.Pi.2K+状態)の結晶構造が明らかになっているが、その後、K+結合に関するNa+,K+-ATPaseの構造解析はほとんどなく、その仕組みはよく分かっていない。そこで、本課題では2個のK+が結合する過程をX線結晶構造解析、電子顕微鏡による単粒子解析によって明らかにし、K+選択的結合とそれらのイベントがどのようにカップリングしているのかを解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Na+ポンプ(Na+,K+-ATPase)によるK+輸送機構、すなわち2個のK+がどのように選択的に結合するとともに脱燐酸化反応が進行するとともに、細胞外側ゲートが閉じて、細胞質側ゲートが開くのか、を原子レベルで明らかにすることを目的としている。
今年度はK+を結合し、脱燐酸化した状態(E2.2K)のクライオ電顕構造を近原子分解能で得ることができた。さらにATPを結合したE2.2K状態(E2.2K.ATP)のクライオ電顕構造も低分解能だが得ることができた。これらの結果からK+を結合した後、どのように細胞外側ゲートを閉じるのか、その詳細が明らかになったほか、細胞質側ゲートのopeningに向けてどのような構造変化が起きるのか、が分かってきた。こうした変化について、同じイオンポンプであるCa2+-ATPaseと比べて、変化の方向性そのものはよく似ているものの、その度合いは大きく異なることが分かってきた。こうした両者の違いは対象とするイオンの存在量や達成すべき濃度勾配の違いに起因するものと考えられた。これらの成果は論文1報にまとめて報告している(R. Kanai, et al. (2022) FEBS Lett., 596(19):2513)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね順調に進んでいる。K+を結合した後の解離過程については複数の経路があり得て状態固定が困難であるため、構造解析が困難と思われたが、意外にもカギとなるE2.2K.ATP状態のクライオ電顕像を低分解能ながら得られたのは予想外の進展である。現在、更なる分解能の向上に取り組んでいる。一方、2個のK結合過程については昨年同様、やや苦戦している。具体的には2個のK+を結合した燐酸化状態(E2P.2K)の構造決定がカギだが、まだ成功には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
K+の解離過程についてはE2.2K.ATP状態の高分解能解析のほか、K+を解離した、次の状態(E1.ATP)の構造決定を急ぐ。
一方、2個のKが結合したE2P状態(E2P.2K)についてはMg濃度が2個目のK結合に大きな影響を与えることから、安定したE2P.2K状態の再現に必要な溶液組成を生化学的に明らかにする。また、その際にはE2P状態に強く固定する阻害剤cardiotonic steroidの利用も検討する。
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Report
(2 results)
Research Products
(5 results)
