Study of temperature resistant mechanisms of papain enzymes by single-molecule measurements
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21K06115
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
梅村 和夫 東京理科大学, 理学部第二部物理学科, 教授 (60281664)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | パパイン / 原子間力顕微鏡 / 近赤外 / カーボンナノチューブ / 1分子 / １分子計測 / 酵素 / 耐熱性 / 近赤外分光 / デジタルホログラフィック顕微鏡 / 1分子計測 / 耐熱性酵素 |
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| Outline of Research at the Start |
パパインは耐熱性プロテアーゼとして知られ、食品加工などに広く用いられている。本研究課題では、酵素パパインと基質ペプチドの相互作用や反応速度定数が温度によってどのように変化するかを1分子（個々の分子）レベルで明らかにする。具体的には、原子間力顕微鏡やデジタルホログラフィック顕微鏡による構造観察・物性測定、蛋白質分子反応をカーボンナノチューブの光スペクトル変化に置き換える独自な測定法を用い、これらの測定を実現するために新規な試料作製方法を提案する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵素パパインの耐熱性について、原子間力顕微鏡（AFM）による1分子液中観察実験と、単層カーボンナノチューブ（SWNT）の近赤外発光（PL）を用いたスペクトル測定実験、さらにデジタルホログラフィック顕微鏡、近赤外顕微鏡による観察実験も試みた。研究成果として、第一に、昨年行ったAFM観察実験について、査読付き論文1報を発表し、国内外での学会発表も行った。第二に、昨年度は室温での液中AFM観察にとどまっていたが、今年度は温度を変化させての液中AFM観察を行うことができた。基板上に孤立して吸着させた個々のパパイン分子を、まず室温の緩衝液中でAFM観察し、続いて液温を37度に温度を上昇させて再観察すると、パパイン分子の体積が大きくなる（膨らむ）ことが明らかになった。続いて温度を室温に戻すと、体積はやや減少するが、完全に元通りにはならなかった。今のところ現象論にとどまっているが、温度を変化させての観察手順が確立されてきたため、同様の手順で活性化したパパイン分子なども観察できると考えられる。第三に、DNAで単分散したSWNTを静電力によってナノ多孔質バイオシリカ（珪藻殻）表面に吸着させ、マイクロデバイス化した。最初に酸化剤でSWNTを消光しておき、その分散液にパパインを添加したところ、SWNTの発光が回復することが分かった。これはパパインの抗酸化能を示していると解釈できる。比較のために還元剤であるジチオスレイトール（DTT）を添加すると、この場合もPL発光が回復した。ただし、パパインとDTTでは、発光回復の度合いがSWNTのキラリティごとに異なり、発光スペクトルによりパパインとDTTを識別できることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高温での1分子AFM観察の手順が確立でき、温度を上下させての繰り返し観察が実現した。現状では現象論的なデータにとどまっているため、次年度は物性測定も行いたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
AFMによる高温での個々の分子観察を行うとともに、AFMを用いた物性測定を行う。SWNTのPLを用いる手法では、スペクトル測定は実験系が確立してきたので多様な条件での測定に入る。ホログラフィック顕微鏡、近赤外顕微鏡観察についてはじっくり実験手順を確立する。研究2年目の結果について論文発表、学会発表を行う。
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Report
(2 results)
Research Products
(8 results)
