| Project/Area Number |
21K06116
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Soka University |
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Principal Investigator |
池口 雅道 創価大学, 理工学部, 教授 (00192477)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Fiscal Year 2023: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | フェリチン / 正味電荷 / 鉄 / 大腸菌 / アオサ / 珪藻 / 緑色硫黄細菌 / 鉄貯蔵 / アセンブリ |
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| Outline of Research at the Start |
フェリチンの鉄取り込み機能にフェリチン分子が持つ負電荷とそれによって作られる球殻構造内部の電位勾配がどのように影響しているのかを探り、フェリチンが負電荷数を増やす方向に進化しているのか、また、脊椎動物ではH鎖に加えてL鎖が登場し、鉄を取り込む仕組みに変化が起こったのかを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
フェリチンは24個のポリペプチドが球殻状に集合したタンパク質で、２価鉄を酸化し、ミネラル化した酸化鉄を球殻内部に貯蔵する。大腸菌フェリチン（EcFtn）の球殻外側表面に位置し、サブユニット間の相互作用に関与していない１~４残基のグルタミン（Q）をグルタミン酸（E）に置換したQE1~QE4変異体、同様に1~４残基のEをQに置換したEQ1~EQ4変異体（これらを総称して正味電荷変異体と呼ぶ）を作製したところ、EQ1~EQ4変異体では変異数の増加に伴って電気泳動の移動度が低下した。ところが、QE1~QE4変異体では電気泳動の移動度が変化しない、すなわち負電荷が増えないことが分かっている。この現象が一般的なものであることを確認するため、EcFtnよりも理論正味電荷数（アスパラギン酸（D）とEの残基数からリジン（K）、アルギニン（R）の残基数減じた数）が大きい、珪藻 Pseudo-nitzschia multiseriesフェリチン（PmFtn）とアオサUlva pertusフェリチン（UpFtn）の正味電荷変異体を作製した。PmFtnのEQ1、EQ2、QE1、QE2変異体はいずれも野生型と同じ電気泳動移動度を示した。またUpFtnのQE1変異体も野生型と同じ電気泳動移動度を示した。よって、PmFtnもUpFtnもEcFtn同様に物理的に可能な最大限の負電荷を有していることが明らかとなった。EcFtnとの違いは、EcFtnでは１つでもEQ変異を導入すれば電気泳動移動度が減少したが、PmFtnでは２つEQ変異を導入しても電気泳動移動度が野生型と同じであった点である。PmFtnはEcFtnよりも理論正味電荷数が大きいためと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
交付申請書の研究実施計画の欄で記述した令和４年度に計画した実験をある程度実施できた。UpFtn、PmFtnの球殻外側表面に位置しサブユニット間の相互作用に関与していないE, Q残基だけでは十分な数の変異を導入できないことが明らかとなったため、変異導入のターゲットとしてD, N（アスパラギン）を探索し、これらをそれぞれN, Dに置換した変異体を作製している。
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| Strategy for Future Research Activity |
UpFtn、PmFtnの球殻外側表面に位置しサブユニット間の相互作用に関与していないD, E残基をそれぞれN, Qに置換した変異体を作製する。野生型よりもD, Eを増やしても負電荷が増えないことが明らかとなったため、D, Eを大幅に減ずる変異体を作製し、これらの変異体が野生型と同様に24量体を形成しているか、またサブユニットの構造に変化がないかを円二色性スペクトル、ゲル濾過クロマトグラフィー、超遠心分析、X線小角散乱で確認する。さらには、これらの変異体についても鉄取り込み機能、熱安定性を調べ、鉄取り込み機能と電荷数、あるいは構造安定性と電荷数の関係を探る。
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