難培養真菌のミニメタゲノム解析法の確立と新規遺伝子の探索

• Project/Area Number: 21K06141
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43060:System genome science-related
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 梅山 大地 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 研究員 (30706370)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 真菌の分離 / メタゲノム解析 / 蛍光ラベル / 磁気分離 / 溶菌酵素 / 真菌叢の分離 / マイクロバイオーム / 真菌叢 / 細胞分離 / ミニメタゲノム / 遺伝子機能解析

Outline of Research at the Start

微生物の99％は培養不可能なため全ゲノム解析は不可能でしたが、遺伝情報が通常一つの環状染色体にコードされる細菌は、メタゲノムデータから環状ゲノムを再構築して全ゲノム解析が可能になりつつあります。しかし、遺伝情報が通常複数の線状染色体にコードされる真菌の全ゲノム解析では、微生物叢から真菌叢を分離して解析する必要があります。このミニメタゲノム解析手法を確立し、微量なマイナー真菌のゲノム解析を可能にすることで、ヒトの共生微生物叢や環境微生物叢に存在する新規の遺伝子配列を明らかにします。併せて本研究では、1細胞解析や長鎖シーケンスへの応用に向けた真菌叢のスフェロプラスト化や核抽出法の検討も行います。

Outline of Annual Research Achievements

昨年度まで真菌の細胞表面に存在するグルカンなどに特異的に結合するプローブを作製してきたが、今年度はそれらの結合能の向上を目指して実験を行った。結合ドメインと蛍光蛋白質を連結するリンカー長の最適化とドメインの多重化を行い、出芽酵母や分裂酵母をモデルに用いて結合能を評価した。ドメインをダイマー化したところ、全てのプローブで結合能の上昇がみられ、トリマー化したところ一部のプローブでわずかに結合能が増大した。しかし、ドメインの連結数を増やすにつれて発現量が低下し、テトラマー化、ペンタマー化しても結合能の上昇は見られなかった。そのため、プローブはダイマーあるいはトリマーとして用いることとした。また、N末端に分子シャペロンを融合したところ、結合能や発現量が上昇したプローブもあったため、それらはシャペロン融合たんぱく質として用いることとした。これらのプローブの発現量の上昇を目的として、開始コドン下流と終止コドン上流にTranslation Enhancer Elementを挿入したところ、全てのプローブで発現量の増大がみられた。また、ヒト糞便50 mgに対するプローブや磁性ビーズの投入量の最適化も行った。
前年度までに見出した細菌特異的な溶菌酵素群の反応最適化を行った。文献検索を行ったところ、Zn2＋を補因子とする酵素も含まれていたため、反応系に添加するZnCl2濃度の最適化を行った。ヒト便に含まれる細菌量を16S rDNAのqPCRで定量したところ、ZnCl2を加えることで４倍程度活性が増大する条件を見出した。また、分子シャペロンの融合や反応時間および緩衝液の組成などの検討を行うことで細菌特異的な溶菌反応の最適化を行った。
前年度までに最適化した密度勾配遠心の条件と今年度最適化したプローブとの結合条件や細菌特異的な溶菌反応条件を組み合わせて、実サンプルからの真菌の濃縮を開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ドメインをモノマーとして用いた初期型のプローブでは、出芽酵母や分裂酵母へ結合させた後の洗浄工程で乖離が見られていたが、結合ドメインをタンデムに連結することで結合能の上昇がみられ、これらの改良型のプローブではほぼ洗浄工程での乖離がみられなくなった。しかし連結数を増やすと発現量の低下がみられたため、研究を効率的に進める上で発現量を改善することが必要となった。そこで開始コドン下流の4残基と終止コドン上流の2残基に既に報告されていた翻訳促進配列を挿入してみたところ、全てのプローブで発現レベルの増大がみられ、結合能の低下はみられなかった。これらの実験結果から、十分な量の改良型プローブが調製できるようになったと判断してプローブ配列の最適化は終了して、多色ラベル化を行うために蛍光蛋白質の変更、ヒト便とプローブの量比の検討、あるいは投入するビーズ量の検討などの当初予定通していたプロトコールの最適化を進めることできた。

Strategy for Future Research Activity

ヒト便を用いて真菌を濃縮するプロトコール全体の最適化に取り組む。16SとITSの存在量をqPCRで定量することにより真菌の収量と純度を追跡し、十分に真菌が濃縮されていることが確認できたサンプルについては、ショットガンシーケンスを行って真菌叢のミニメタゲノム情報を得る。真菌の純度が十分でない場合は、密度勾配遠心やFACSで細胞を分取する条件を変更し、収量よりも純度を優先して決定する。プロトコール全体を最適化した後は、土壌、河川や海水などの実サンプルに含まれる真菌叢のミニメタゲノム解析を行う。また、真菌ゲノムのシングルセル解析を行うために、多様な真菌に適用可能なスフェロプラスト化法の検討に着手する。