| Project/Area Number |
21K06143
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43060:System genome science-related
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| Research Institution | National Center for Child Health and Development |
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Principal Investigator |
岡村 浩司 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 室長 (80456194)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | リプログラミング / DNAメチル化 / 遺伝子発現 / ヒストンメチル化 / クロマチン / 遺伝子発現制御 / iPS細胞 / エピゲノムエディティング |
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| Outline of Research at the Start |
遺伝子発現の制御に重要なDNAのメチル化は、現在ではゲノム編集を応用した技術により標的領域の状態を制御することが可能となった。しかしながらプロモータ領域のメチル化状態が発現と関わる遺伝子はむしろ少数であり、任意の遺伝子に対して発現操作を行うことができる状況に至っていない。本研究ではiPS細胞とその親株というサンプル対を用い、塩基配列に依存する効果と細胞不均一性を排除した上で、細胞のリプログラミング前後における発現とメチル化状態を比較し、発現に関わるメチル化サイトを同定、がん抑制遺伝子などを制御するエピゲノム療法、また人為的な発現制御を必要とする再生医療などに有用な基礎データを構築する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
脊椎動物の個体にはさまざまな器官や組織、細胞が存在し、それぞれにおいて異なる遺伝子の組み合わせの発現制御がなされている。本課題の目標は多くの遺伝子について、それぞれの発現に関わるDNAメチル化サイトを同定することで、まず、ヒト子宮内膜由来細胞およびそのiPS細胞株との比較解析から、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)遺伝子群について結果が得られた。MMPはコラーゲンなど細胞外マトリックスを分解する酵素で、月経における剥離、脱落にも関与し、子宮内膜間質細胞においてはMMP1やMMP2の高発現が確認される。この細胞を親株としてリプログラミングによりiPS細胞株を樹立させると、幹細胞においては不要である上記2遺伝子のmRNA発現量は1/10以下に抑制される。メチル化アレイによるデータから、MMP1についてはプロモータ領域の1つのCpGサイトが重要であることを示すことができた。MMP2についてはgene bodyの離散的な数ヶ所の高メチル化が観察され、またCpGアイランドとなっているプロモータ領域ではH3K4me3修飾が細胞のリプログラミングにより消失することが確認された。また、MMP20については子宮における機能と関わりがないためか発現しておらず、iPS細胞でもオフのままであるが顕著な高メチル化を受けていることが分かった。MMP20に関する制御情報を得るためには、子宮内膜とは別のMMP20が発現している細胞をリプログラミングする必要がある。MMP1を含むMMPファミリー9遺伝子は11q22で同じ向きに遺伝子クラスタを形成しており、Hi-Cによるデータからその中にクロマチン境界を確認、メチル化が変化する遺伝子座とそうでない遺伝子座の区分けがなされ、遺伝子重複後のパラログの機能多様化をもたらす機構を追うことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
子宮内膜由来の細胞株Edom22、およびそのiPS細胞複数株について、マイクロアレイを利用した遺伝子発現解析、およびDNAメチル化解析を行ったところ、リプログラミングによる高メチル化でiPS細胞での発現量が10分の1以下となる遺伝子座を12同定することができた。その中にマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)をコードするMMP1、MMP3、およびMMP12が含まれていたことからこの遺伝子ファミリーに特に着目して解析を進めた。これら3遺伝子は月経に深く関わると予想され、さらに発現量が10分の1以下とはならなかったものの、iPS細胞複数株で同様に発現が抑えられている遺伝子としてMMP2を確認することもできた。さらにこれらの遺伝子に対し、同一個体で異なる年に採取された線維芽細胞4株についても同様なデータを取得し、Edom22と比較することができたため、順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
開始から2年間、DNAメチル化解析は遺伝子発現同様、マイクロアレイを利用したハイブリダイゼーションによるデータを利用してきた。安価に結果を得られる一方で、プロモータ領域以外のプローブについては密に用意されているわけでななく、例えばMMP2についてはgene bodyの離散的な数ヶ所の高メチル化が観察され、発現抑制に強く関わっている可能性が示されたものの、DNAメチル化がどの程度の広がりをもって変化したかを把握することができていない。そこで次の段階としては、バイサルファイト処理後のゲノム断片からライブラリを作成し、次世代シークエンサによるシークエンシングの手法を用いて、より高解像度な解析を行うことを検討している。
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