メダカ椎間における硬節細胞の多分化能の検証とWntによる未分化性維持機構の解析

• Project/Area Number: 21K06245
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 44040:Morphology and anatomical structure-related
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 猪早 敬二 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (70302958)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: メダカ / 硬節細胞 / 骨芽細胞 / 細胞分化 / 脊椎発生 / 多分化能 / Wnt

Outline of Research at the Start

メダカ脊椎の椎間領域(椎間板に相当する組織)は骨成長の場であると共に、硬節に由来する骨芽細胞の前駆細胞が未分化の状態で維持されていると考えられる。これらの硬節由来細胞が骨芽細胞へと早期に異常分化することで、脊椎骨融合の表現型を示すメダカ変異体の解析を行ったところ、硬節由来細胞の未分化性の維持には、Wntファミリーに属する2つの遺伝子が必須であることが分かった。本研究ではまず、Wnt遺伝子のターゲットや硬節由来細胞の分化を制御する分子カスケードを明らかにする。また硬節細胞は、血管壁細胞や腱細胞にも分化することが報告されている。本研究では、椎間域の硬節由来細胞の多分化能の有無についても精査する。

Outline of Annual Research Achievements

メダカ脊椎の椎間領域(椎間板に相当する組織)は骨成長の場であると共に、硬節に由来する骨芽細胞の前駆細胞が未分化の状態で維持されていると考えられる。これらの硬節由来細胞の未分化性の維持には、Wntファミリーに属する遺伝子、wnt4bが必須であることがメダカ変異体の解析で分かった。本研究では、硬節由来細胞の分化を制御する分子カスケードを明らかにするとともに、椎間域の硬節由来細胞の多分化能の有無についても精査することを目的としている。初年度では、硬節マーカー遺伝子のプロモーター制御下で、Creリコンビナーゼを発現するトランスジェニックメダカ系統を作製し、loxPメダカ（骨芽細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーター制御下で普段はDsRed、Cre存在下でEGFPを発現誘導するトランスジェニック系統）と交配することで、メダカの硬節細胞が骨芽細胞へと分化していることを明らかにした。本年度では、硬節マーカー遺伝子のメダカ変異体の作製を試みた。CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術を用いることで、硬節マーカー遺伝子のメダカ変異体を複数作製し、系統化することに成功した。これらの変異体は、硬節マーカー遺伝子をコードするゲノムDNAに数塩基の挿入や欠失を持つため、フレームシフト型の変異が生じ、硬節マーカー遺伝子の機能に異常が起こることが大いに期待された。次に、これらの変異体の表現型を精査したところ、脊椎の骨芽細胞の発生に異常が見られ、その結果として脊椎骨の形成不全が起こることが明らかとなった。このことは、メダカの硬節細胞が骨芽細胞へと分化するという本研究初年度の研究結果を支持し、さらにメダカの硬節細胞が脊椎骨の形成に関与していることを強く示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、硬節由来細胞の分化を制御する分子カスケードを明らかにするとともに、椎間域の硬節由来細胞の多分化能の有無についても精査することを目的としている。初年度では、本研究を推進するために必要な複数のトランスジェニック系統を作製することができた。また本年度では、硬節由来細胞の発生に関わる複数のメダカ変異体の作製に成功することができた。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、初年度に系統化されたトランスジェニックメダカを用いて、本年度で作製されたメダカ変異体の詳細な解析を行う予定である。また系統化されたトランスジェニックメダカを用いて、硬節由来細胞の追跡実験を行うことで、多分化能の有無を明らかにする。さらに、メダカ変異体と野生型でRNAシーケンシング解析を行い、硬節由来細胞の分化に関与する候補遺伝子を明らかにする。