甲殻類自律運動器官における自律メカニズムの転換機構

Research Project

Project/Area Number	21K06271
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 44050:Animal physiological chemistry, physiology and behavioral biology-related
Research Institution	Kyorin University
Principal Investigator	田中浩輔杏林大学, 保健学部, 教授 (50236585)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	伊藤慎杏林大学, 保健学部, 講師 (00460139)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Keywords	甲殻類 / RNAseq / トランスクリプトーム解析 / モノアミン受容体 / 自動能 / 個体発生 / ペースメーカー
Outline of Research at the Start	甲殻類の自律運動器官（心臓や消化管）は、横紋筋様組織で構成され、神経原性により自律運動を発現するものが知られている。本研究では、まず主に心臓神経節ニューロンおよび心筋の活動電位を構成するイオンメカニズムを電気生理学的に調べる。次に、網羅的なRNA発現解析を行い、イオンチャネルの発現を組織ごとに調べる。さらに個体発生における自動性の変移、および筋原性を保持している種との比較により、筋原性から神経原性への転換メカニズムを解明する。
Outline of Annual Research Achievements	甲殻類の自律運動器官の自動性の源を調べるため、クルマエビ成体の心臓や腸管を用い自動性の発現機構を明らかにすることを目的として分子生物学的アプローチによる研究を主に進めた。昨年度までに収集した基礎データの解析を進めた。具体的には、クルマエビ成体を用いてターゲットとなる自立運動器官を含む代表的ないくつかの部位（心臓、消化管、筋肉、中枢神経系）より抽出したtotal RNAを混合したサンプルについて、RNAseq解析を行った。これらのアノテーション情報を付加したデータに関して、心臓の自律運動に関与しているHCN channel及び自律神経系に深く関与しているモノアミン関連の受容体について解析を行った。 HCN channelに関しては、４つのトランスクリプトームがそれぞれ、Tribolium castaneum 2種類, Hyalella azteca, Penaeus vannameiらの動物種に対して一致度78％以上で高いホモロジーを持つことが示唆された。今後、これらの情報を元に保存性が高い配列を検討し、クローニング及び発現部位について検討を行う。また、心筋や腸管を構成する筋の活動を修飾するモノアミン類に関するレセプターについては、オクトパミン、ドーパミンおよびセロトニンのレセプターとみられるトランスクリプトーム情報で、既存のデータベースに対して高いホモロジーを持つことが示唆された。これらのうちDopamine like receptor2及びOctopamine receptor Beta-2R likeそれぞれについて、RT-PCRにより解析を行ったところ、ドーパミン様レセプターに関しては、腸において、強い発現が観察された。一方、オクトパミン様レセプターに関しては、中枢、筋肉、心臓にて発現が観察された事から、少なくとも、生体内に発現している事が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 分子生物学的手法を用いた解析に関しては、RNAseqによるmRNAライブラリーから、既存の無脊椎動物の遺伝情報と　これまでの神経伝達物質の受容器に加え、ターゲットの1つのcation channelの遺伝子配列との比較するBLAST検索を行ったが、in situ hybridization などにより発現部位の詳細な特定などがまだできておらず、やや遅れている。一方、生理学的手法に関しては、心筋および腸管構成筋に対して薬理学的及び電気生理学的特徴を調べる実験を試みたが、細胞内通電による筋原性反応の惹起ができず、テトロドトキシン投与下で筋の薬理特性を確定するに至らなかった。特に腸管の組織標本監察の結果腸管の筋層厚さが薄いことはわかり、細胞内誘導法を用いた薬理学的実験にさらなる工夫の必要性が生じている。今後、イオン濃度を変化させる等の手法により自律運動を構成する筋の性質を引き続き明らかに必要がある。したがって、総合的に遅れていると評価した。
Strategy for Future Research Activity	HCN channelに関しては、４つのトランスクリプトームがそれぞれ、Tribolium castaneum 2種類, Hyalella azteca, Penaeus vannameiらの動物種に対して一致度78％以上で高いホモロジーを持つことが示唆されたことから、今後、これらの情報を元に保存性が高い配列を検討し、クローニング及び発現部位について検討を行う。ただし、上記4つの元となるトランスクリプトーム情報については、クローニングされたものではない事から、慎重に解析を行う必要がある。今後は、他の候補トランスクリプトームについても具体的な解析、クローニング、In situ hybridizationによる組織学的解析などを行う。次に、腸管からの細胞内誘導法を確立させ、薬理学的に惹起される自律運動の起こすイオンメカニズムをイオン濃度の変化、通電による応答性などを調べ詳しい特徴づけを行う。また、神経原性はニューロンの出現と対応するので、クルマエビを用いた幼生における、形態の変化を組織学的に調べ、特に個体発生過程上の特定の時期（プロトゾエア期～ポストラーバ期初期）ニューロンの出現の有無を調べる。