コレラ菌における突然変異バイアスとビルレンス変調に関する研究

• Project/Area Number: 21K06288
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 45020:Evolutionary biology-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岡田 和久 大阪大学, 微生物病研究所, 特任准教授(常勤) (40420434)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: コレラ菌 / 変異 / 環境適応 / 鞭毛運動 / VNC / 変異バイアス / 病原性 / 進化 / 分子進化

Outline of Research at the Start

細菌の進化において非ランダム突然変異及び適応的突然変異の関与はよく理解されていない。申請者は特殊環境下で培養したコレラ菌において、ゲノムに非ランダム的な変異が生じている現象を見出した。
本研究の目的は生命進化は偶然に生じる突然変異に委ねられているのではなく、特殊環境のストレス下に置かれた生物は一定方向の変異バイアスを発生させ、ある種の適応的突然変異へと導き、生存・進化に影響を与えるという可能性を検証・追究することにある。
貧栄養下の長期培養時にみとめられる変異バイアスによる運動性消失と培養能の変化及び変異バイアスとビルレンス変調について解析を行う。

Outline of Annual Research Achievements

細菌の進化において非ランダム突然変異及び適応突然変異の関与についての理解はきわめて不充分である。本研究は、コレラ菌の特殊環境下で認めた非ランダム突然変異について検証し、さらにその変異がコレラ菌にもたらす意義について理解することを目的としている。
本年度に行った実験結果においても、コレラ菌を貧栄養下で長期培養すると鞭毛関連遺伝子に選択的に変異が発生する現象が示された。この変異による運動性の消失・低下は、生存しているが培養できない状態（VNC）への移行を抑制することが示唆された。　そこで次に化学物質（ポリミキシンB）を用いて運動性を抑制する実験を行った結果、ポリミキシンBはコレラ菌の運動性を低下させると共に、VNCへの移行を抑制する効果を示し、遺伝子変異によらない化学物理的な作用でも効果があることが示唆された。
コレラ菌を300日間まで長期培養した結果、代謝関連遺伝子の変異や病原性関連因子（CTXファージ等）および大規模なDNA領域（約35 kb）を欠損した様々な株を認めた。また、その長期培養後の一部の培養液を新鮮なLB培地に移した場合、運動性欠損株が野生株よりも早くポピュレーションが増加することが示された。短期間で多くの変異を示した株にmutS遺伝子（DNAミスマッチ修復に関与するタンパク質をコードする遺伝子）の変異を認めため、実際に野生株のmutS遺伝子を破壊し、培養60日目に遺伝子解析を行なったこところ、野生株は平均5個の遺伝子に変異が発生する一方で、mutS欠損株は平均23個の遺伝子の変異が検出され、mutS遺伝子の欠損は本条件において、変異の発生を増加させることが示唆された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本研究は、グルコースと無機塩類を含むM9培地でコレラ菌をバッチ培養し、ゲノムおよび表現型の変化を経時的に追跡した。長期培養初期において鞭毛関連遺伝子（計17種類）に変異を伴う多くの株を分離した。一方、他のゲノム領域は高い保存性を示したため、運動性を欠損させる選択的な変異が生じたことが示唆された。この鞭毛関連遺伝子の変異現象は、人工海水培地でも認められた。変異に伴う運動性の欠損・低下はコレラ菌の生きているが培養出来ない状態（VNC）への移行を抑制し、培養能の持続に寄与した。しかし、300日に渡る培養の結果は、代謝関連遺伝子の変異やCTXファージなどのビルレンス因子の脱落、大規模なDNA領域（約35 kb）の喪失を伴い、生存可能な環境を限定させていることが示唆された。
以上の様に進展した結果結論が得られたため。

Strategy for Future Research Activity

発生した変異と病原性に関わる変化を追究するため、以下のことを行う。１)変異株のコレラ毒素産生能の変化、　２)　本条件下で発生した生存しているが培養ができない状態に移行したコレラ菌について、適当な培養条件を見出し、増殖能の復帰を試みる。　３）他の培養条件で変異発生パタンを解析する。
学術雑誌や学会で本研究成果を発表する。