Elucidation of Ca sparks in CNS presynaptic terminals

Research Project

Project/Area Number	21K06398
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	中村行宏東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (40460696)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2022: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000) Fiscal Year 2021: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Keywords	シナプス前終末 / カルシウム / シナプス伝達 / Held萼状シナプス / カルシウムイメージング
Outline of Research at the Start	シナプス前終末における細胞内Ca濃度の上昇は、通常活動電位によって活性化した電位依存性Caチャネルを介したCa流入によって生じ、神経伝達物質の開口放出を誘導する。しかし申請者はこれまでのCaイメージング実験の過程で、脳幹のHeld萼状シナプスの巨大前終末では、活動電位の発生とは同期しないCa濃度の上昇がしばしば起きることに偶然気付いた。Ca sparkと名付けたこの現象は、伝達物質の放出とも無関係のようであり、その発生のしくみや機能は分かっていない。本研究ではCa sparkの発生機序や生理学的意義を解明し、中枢神経シナプス前終末における新しいCa制御機構についての知見を得る。
Outline of Annual Research Achievements	脳幹聴覚伝導路上の萼状シナプスの巨大シナプス前終末において、活動電位非依存的に発生する一過性の上昇を‘Caスパーク’と呼ぶ。CMOSカメラを用いたCaイメージングによって、Caスパークは聴覚獲得前の生後１週齢のシナプス前終末ではほとんど観察されないことが昨年度の研究によって明らかになっていた。そこで本年度は生後２週齢（以降）のシナプスに焦点を絞って研究を進めた。ガラスパッチ電極よりシナプス前終末に高親和性の蛍光Ca感受性色素Calbryteを注入し、新たに導入した共焦点レーザー顕微鏡を用いてシナプス前終末内におけるCaスパークの発生部位を調べた。Caスパークは、主にシナプス前終末の枝分かれして膨大した先端部（swellings）で発生し、軸索や軸索と接続する細い幹（stalk）ではほとんど観察されなかった。電位依存性カルシウムチャネルCaV2.1阻害剤omega-Agatoxinを投与したところ、Caスパークの振幅は微減したが、発生頻度には影響しなかった。電位依存性カルシウムチャネルを介したCaイオン流入はCaスパーク発生の主因ではないと考えられる。さらにCaイメージングと同時に後シナプスの台形体核神経細胞からシナプス後電流を記録したところ、Caスパークの発生は微小シナプス電流と同期する様子は認められなかった。Caスパークはシナプス伝達には直接関与しない生理現象である可能性が示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度のコロナ禍による研究機器納入や実験進捗の遅延をほぼ回復し、およそ計画当初のスケジュールに沿って進展している。
Strategy for Future Research Activity	これまではシナプス前末端へ直接パッチクランプしたガラス電極からCa感受性蛍光色素を導入していたが、技術的に困難な実験であり効率はよくなかった。そこでHeld萼状シナプスの巨大シナプス前終末に遺伝的にコードされたCaセンサータンパク質GCaMP6fを発現した動物の作成をすすめている。この動物を用いることにより、Caイメージングに際してシナプス前終末へパッチクランプ必要がなくなり、実験効率の向上が期待できる。シナプス前終末の膜電位を記録しないため、通常のシナプスでは自発発火によるCa上昇と発火によらないCa sparkを識別できない。しかし、脳幹スライス中のHeld萼状シナプスのin situ標本では巨大シナプス前終末に自発発火が生じないことが知られており、Caイメージングによって観察されるCa濃度上昇はすべてCa sparkであるとみなせる。Ca sparkの発生機序を調べる最終年度の薬理学的・分子生物学的実験ではこの動物を使用していきたい。