| Project/Area Number |
21K06600
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47040:Pharmacology-related
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鬼頭 宏彰 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (40749181)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 骨芽細胞 / 細胞分化 / 内向き整流性カリウムチャネル / カルシウムシグナル / Kir2.1 |
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| Outline of Research at the Start |
K+チャネルはCa2+シグナルを制御することにより、様々な細胞種において生理的役割を果たす。骨組織は骨リモデリングによりその恒常性を保っており、その破綻が多くの骨代謝性疾患の原因となっている。骨代謝性疾患の治療薬の開発戦略の中で、骨芽細胞機能の制御機構の解明が注目をされているが、前骨芽細胞に機能発現するK+チャネルが骨組織恒常性機構において、どのような役割を果たしているのかは明らかにされていない。本研究の目的は、骨芽細胞分化におけるK+チャネルの役割を解明し、骨形成の分子機構におけるK+チャネルの生理的意義を解明することで、骨代謝疾患治療を指向したイオンチャネル創薬戦略を考案することである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
前骨芽細胞の細胞増殖・細胞分化は骨組織恒常性維持において重要な役割を果たしている。我々は、マウス前骨芽細胞MC3T3-E1を用いて細胞増殖・細胞分化におけるイオンチャネルの役割を検討した。これまでの検討により、MC3T3-E1細胞には中コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルKCa3.1が機能発現し細胞増殖を促進するのに対して、内向き整流性カリウムチャネルKir2.1が骨芽細胞分化により発現が亢進することを明らかにしている。本検討において、骨芽細胞分化に伴うKir2.1発現亢進が細胞内カルシウムシグナルを亢進させて骨芽細胞分化を促進することを示した。培養細胞に加えてマウス胎児より単離した中足骨を用いた軟骨内骨化モデルにおいてもKir2.1阻害薬は骨石灰化を抑制したことから軟骨内骨化の制御においても重要な役割を果たすことが示された。また、骨芽細胞分化にともなうKir2.1発現亢進メカニズムを検討したところ、microRNA網羅解析やmicroRNA阻害薬、microRNA mimicを用いた検討から、microRNAを介した制御が重要な役割を果たすことが示された。骨芽細胞におけるカリウムチャネル活性化を介した過分極が骨芽細胞機能に与える影響に関して今後さらなる検討が必要である。
これまでの継続した研究成果より、KCa3.1及びKir2.1は骨芽細胞増殖及び細胞分化の制御において重要な役割を果たすことを明らかにしてきた。今後はこれらの知見を基に骨代謝疾患における骨形成制御を目的としたイオンチャネル創薬の標的分子としての可能性を検討していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前骨芽細胞、骨芽細胞を含む骨芽細胞関連細胞の細胞増殖・細胞分化は骨形成において重要な役割を果たしていると考えられている。骨芽細胞において中コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルKCa3.1は前骨芽細胞増殖を促進するのに対して、骨芽細胞分化条件下ではKCa3.1発現が減少に伴い内向き整流性カリウムチャネルKir2.1の発現活性が亢進することを明らかにした。Kir2.1阻害薬ML133は、骨芽細胞分化マーカーであるALPやBSPの発現を有意に減少させた。またsiRNAを用いたKir2.1発現抑制実験はALP発現を減少させた一方で、Kir2.1強制発現はALPの発現減少を回復させた。Kir2.1の活性化は細胞膜の過分極を介した細胞内カルシム流入制御により骨芽細胞分化を促進することが示唆された。骨組織レベルでのKir2.1の役割を検討するために、マウス胎児中足骨を用いた軟骨内骨化モデルを用いて検討したところ、Kir2.1が骨組織の石灰化にも大きく寄与することが明らかとなった。骨芽細胞分化によるKir2.1の発現亢進機構を解明するために、miRNA発現解析を行った。Kir2.1mRNAに結合する可能性を持つmiRNAをデータベース上で検索し、骨芽細胞分化に伴う網羅的なmiRNAの発現変動の結果と照合することでKir2.1発現制御に関わる可能性を持つ12の候補miRNAを選出した。それぞれのmiRNAの阻害剤やmimic体を用いて検討したところ、骨芽細胞分化に伴うKir2.1発現亢進制御に関わる分子としてmiR-106-5pを同定した。また、生体内における骨代謝への寄与を検討するために大腿骨損傷モデルマウスを作成し始めているが条件等に時間を要しており実験期間の延長を申請した。
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| Strategy for Future Research Activity |
骨芽細胞における細胞分化制御におけるイオンチャネルの関与をより詳細に検討するために、培養細胞や単離骨組織だけではなくマウス骨損傷モデルを利用することでinvivoの骨形成におけるKir2.1の役割を明らかにする。
骨芽細胞分化に伴うKir2.1の発現亢進は細胞膜の過分極及びカルシウム流入を促進する。骨芽細胞はギャップジャンクションを介して細胞間シグナル伝達を行っていると考えられていることから、Kir2.1を介した膜電位やカルシウムシグナルも細胞間伝播により骨芽細胞分化シグナルを形成する可能性が考えられる。骨芽細胞に機能発現するconnexin43やpannexin3を介した細胞間シグナル伝播について検討するとともに、これら両分子のhemichannelとしてのATP分泌を介した細胞分化制御に関しても検討を行うことで、細胞膜の過分極による骨芽細胞分化制御メカニズムを明らかにする。
また、細胞増殖・分化の制御におけるCa2+シグナルの役割を明らかにするために、骨芽細胞が分泌するサイトカインや細胞間因子を用いてKCa3.1やKir2.1への影響を検討する。特に骨芽細胞の産生するインスリン様成長因子（IGF）や線維芽細胞成長因子（FGF）の発現変化や各因子に対する感受性変化に注目し、骨機能制御に関連する生理活性物質とイオンチャネル活性との関連を明らかにする。
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