| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Outline of Research at the Start |
抗結核薬D-サイクロセリン（D-CS）の生産菌から, 新規のアルギニン水酸化酵素DcsAの電子伝達系を同定する。同定した電子伝達系をコードする遺伝子, DcsAをコードするdcsA遺伝子, および, ヒドロキシアルギナーゼをコードするdcsB遺伝子を同時に大腸菌に導入することにより, 大腸菌を宿主としたヒドロキシウレア（HU）の生産システムを構築する。また, 新たに構築したHU生産システム, および, これまでに構築したD-CS生産システムを統合することにより, 大腸菌を宿主としたD-CSの実用レベル大量生産システムを確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度まで, アルギニン水酸化酵素DcsAの電子伝達系を同定するため, D-サイクロセリン生産菌由来のフェレドキシン（FDX）およびFDX還元酵素（FDR）を大腸菌において発現させ, それらの精製を実施した。しかしながら, FDRについては, 活性を保持していると考えられるタンパク質を取得することができなかった。そこで, 最終年度である本年度においては, 電子伝達系として, Pseudomonas putida由来のプチダレドキシン（PDX）およびPDX還元酵素（PDR）を大腸菌で発現させることを試みた。
まず, PDXおよびPDRをコードする遺伝子（pdxおよびpdr）を大腸菌のコドンに最適化した人工遺伝子を合成し, それらを保有するプラスミドpUCFa_pdxおよびpUCFa_pdrを構築した。pUCFa_pdxおよびpUCFa_pdrをNdeIおよびXhoIで消化することにより, pdxおよびpdrを切り出し, 同制限酵素で消化したpET-21a(+)に挿入することにより, 発現プラスミドpET-21a(+)_pdxおよびpET-21a(+)_pdrを構築した。続いて, 構築した発現プラスミドを大腸菌BL21(DE3)株に導入することにより, PDXおよびPDR用発現大腸菌を作製した。PDXおよびPDRの発現は, Overnight Express Autoinduction System 1を用いて, 自動誘導により行った。SDS-PAGEによる解析の結果, PDXおよびPDRは可溶性のタンパク質として発現することが明らかになった。
研究期間全体を通して, 研究の進捗が遅く, DcsAの電子伝達系を見出すという目的を達成するまでには至らなかった。
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