Evaluation method of skin sensitization using chromophore-based solid phase peptide reaction assay in vitro.
Project/Area Number |
21K06673
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
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Research Institution | Tokyo University of Science, Yamaguchi |
Principal Investigator |
有海 秀人 山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 准教授 (70454874)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
臼井 健二 甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 准教授 (70543792)
浜田 芳男 甲南大学, フロンティアサイエンス研究科, 特別研究員 (70424968)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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Keywords | 皮膚感作性試験 / DPRA法 |
Outline of Research at the Start |
近年、化学物質による皮膚感作の成立過程における様々な主な事象に着目した皮膚感作試験法の開発が進められている。その代表的な方法がペプチド結合性試験(DPRA)である。このDPRA試験は、被険物質とタンパク質の結合性を評価し、皮膚感作の発生トリガーの可能性を検出することができる。しかし、DPRA法を用いた被険物質の測定は水溶液中で行われるため、疎水性の高い物質の測定が困難であるなど、いくつかの問題点も存在する。そこで本研究では、難水溶性の被険物質を測定することができるような工夫を施し、基礎的研究のみならず、実社会に即した難水溶性の被険物質として、精油に含まれる成分の皮膚感作性試験を検証する。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、親水・疎水両溶媒になじむレジン樹脂に固定化したペプチドを用いることで、難水溶性物質の皮膚感作性試験を可能とし、被険物質と結合していない高純度ペプチド(リジン、システイン)に対して、リジン残基に対してピクリン酸の指示薬を、システイン残基に対してエルマン試薬の指示薬を組み合わせることで、分光法で検出が可能な極めて簡便な試験法の開発である。現行の皮膚感作性試験の1つにDPRA法が用いられているが、ペプチド(リジン、システイン)と被験物質の結合をHPLCで確認する。その皮膚感作の可否は、HPLCを用いて長い時間を要する。 R4年度の研究実績では、皮膚感作性を示すシンナムアルデヒド、pベンゾキノン、フルオレッセインイソチオシアネートで高純度ペプチド(リジン、システイン)と高い結合性を示すことが示された。一方、陰性対照物質であるイソプロパノール、エタノールでは高純度ペプチド(リジン、システイン)との結合は示さなかった。さらに、現行のDPRA法では、HPLCの操作と長い反応時間を要するが、本研究ではペプチド(リジン、システイン)と被験物質の反応時間を2、4、16、24時間と条件を検討した。その結果、少なくとも4時間の反応が迅速かつ十分な最適な時間であることが明らかになった。 また、レジン樹脂に固定化したペプチドの設計も実施している。当初はTentagel resinにペプチドを固定していたが、使用の前にはペプチドを膨潤し、保存する際には乾燥をさせる必要があるなど、レジン樹脂に固定化したペプチドの取り扱いに難儀するといった問題があった。そこで、R4年度よりPEGA resin (Amino PEGA resin)を常に膨潤された状態で使用できることや溶媒と均一に膨潤しやすいためペプチドが感作性物質と反応しやすいことを考慮し、データのばらつきが各段に改善した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍等の影響により、HPLC(高速液体クロマトグラフィー:ジーエルサイエンス(株))の納入が遅れたが、R4年度内に購入することができた。R4年の実績を基にDPRA法を用いて、被験物質のシンナムアルデヒド、pベンゾキノン、フルオレッセインイソチオシアネートのペプチド結合実験をHPLC法で確認する(5年度9月まで)。
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Strategy for Future Research Activity |
R4年度の実績である、樹脂に固定化したペプチドの設計をPEGA resin (Amino PEGA resin)に改良したことにより、効率的な実験を行うことが可能となった。最終年度であるR5年度は、既にOECDテストガイドラインに掲載されているDPRA法を、本施設でもシンナムアルデヒド、pベンゾキノン、フルオレッセインイソチオシアネートのペプチド結合実験を行い、新たな皮膚感作性試験結果と整合性を確認する。
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Report
(2 results)
Research Products
(6 results)