長鎖ノンコーディングRNA Malat1による分枝形態形成の調節機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K06762
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 48010:Anatomy-related
Research Institution	Kitasato University
Principal Investigator	林徹北里大学, 医療衛生学部, 講師 (10454266)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	猪俣恵明海大学, 歯学部, 准教授 (40553798)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000) Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	Malat1 / 顎下腺 / RNA / 形態形成 / 長鎖ノンコーディングRNA / 分枝形態形成
Outline of Research at the Start	器官固有の働きはその形態と密接に関係しています。形態を理解することは基礎医学の礎であり、特に発生過程の「形づくり」をつまびらかにすることが必須です。器官形成において上皮と間葉が相互作用し、上皮が枝分かれを繰り返しながら伸長する「形づくり」の様式を分枝形態形成といいます。この様式において長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA) による調節機構が存在すると考えられますが、申請者はlncRNAのMalat1が胎仔マウス顎下腺の分枝形態形成を調節することを見出しました。本研究は胎仔マウス顎下腺をモデル器官原基とし、分枝形態形成におけるMalat1の機能を明らかにします。
Outline of Annual Research Achievements	上皮が枝分かれを繰り返しながら伸長していく形づくりの様式は分枝形態形成と呼ばれ、そのモデル器官としては胎仔マウスの顎下腺が知られています。研究代表者はこれまでに胎仔マウス顎下腺を材料とし、遺伝子の発現レベルを調節するRNA（具体的には、タンパク質をコードしないノンコーディングRNA）が分枝形態形成に与える影響について調べてきました。本研究課題ではノンコーディングRNAのうち、200塩基以上の長鎖RNAを研究対象としています。Malat1は長鎖ノンコーディングRNAのひとつですが、分枝形態形成に関与することは知られていません。そのような中、予備実験にてMalat1が分枝形態形成を調節しうること見出しました。そこで当該年度はMalat1のin situ hybridization による局在解析を中心に進めました。方法としてはまず、Malat1の塩基配列をデータベースから取得し、プライマーを作成しました。つぎに作成したプライマーを用いてMalat1 転写産物の一部と相補的に結合するプローブを合成しました。一方、胎仔マウス顎下腺については急速凍結させて薄い切片を用意しました。プローブを切片に滴下し反応させると、Malat1が発現している細胞や組織が青く染色されます（in situ hybridization）。その結果、顎下腺の発生ステージによってMalat1の発現レベルや発現部位が大きく変動することが示唆されました。このことから分枝形態形成をはじめとする顎下腺の発生過程にMalat1が寄与している可能性が考えられます。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 胎仔マウス顎下腺に発現するMalat1 については文献情報がありません。したがって定量PCR（前年度実施）とin situ hybridizationとを実施することで、まずは基礎的な知見を集めました。in situ hybridization用に複数のプローブを設計・合成し、それらの評価を慎重に実施したため少々時間がかかりましたが、信頼できる良いデータが得られたと考えています。一方、Malat1と相互作用する生体分子を明らかにする実験も進める予定でしたが、こちらに関してはやや遅れが生じています。長鎖ノンコーディングRNAの機能解析における標準的な手法は未だ無いため、条件検討も含めて進めています。
Strategy for Future Research Activity	胎仔マウス顎下腺に発現するMalat1 に関して基礎的な知見を集めることができました。したがってやや遅れの生じているMalat1の機能解析に注力します。具体的にはMalat1と複合体を形成する生体分子を特定するためにプローブを作ります（in situ hybridization に用いたプローブとは全く異なります）。このプローブはMalat1を標的として設計しますが、Malat1全長に対してどの部分を狙うかが重要です。長鎖ノンコーディングRNA解析に関する文献を参照すると、プローブの設計・評価方法にいくつかの異なる手法があります。例えばMalat1転写産物全長6983塩基のうち数百塩基をカバーするには、20塩基程度のプローブを50パターン程度用意する必要があります。さらにプローブは化学修飾が必要でありコストに大きく影響するため、慎重に検討せざるを得ません。ご支援頂いた研究費を活用し研究を確実に進めるため、多少の遅れは想定内として覚悟をしています。