| Project/Area Number |
21K06771
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48020:Physiology-related
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
粂 慎一郎 大分大学, 医学部, 助教 (90794579)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | イオンチャネル / hERGチャネル / 構造機能連関 / 分子生物学 / 電気生理学 |
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| Outline of Research at the Start |
hERGチャネルは、細胞膜の電位変化に応じて開閉し、細胞内外のカリウムイオンを輸送する、電位作動性カリウムチャネル（Kv）の1つである。しかし、他のKvでは見られない「Non-domain swapped構造」をとり、それに伴い細胞膜直下の領域に複数の固有ドメインが集中している。また、他のKvと比較して、開状態から閉状態への遷移が非常に遅い。
本研究では、上述の複数の固有ドメイン間の相互作用に焦点を当て、新たに光学的手法（FRET）を導入することにより、分子全体の構造変化に関する固有ドメイン間の相互作用の役割を解析し、hERGチャネル独自の分子構造と機能との関係性の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
電位作動性カリウムチャネルファミリーに属するhERGチャネルは、膜貫通領域に見られるNon-domain swapped構造をはじめ、N末端およびＣ末端細胞内領域に複数の固有ドメインを有するなどの分子的な特徴をもつ。また、それに伴い膜貫通領域の直下に4つの細胞内ドメイン（N末端側からN-tailドメイン、S2-S3リンカードメイン、S4-S5リンカードメインおよびCリンカードメイン）が存在し、それぞれが近傍に配置される分子構造をとる。我々はこれまでの研究において、これら4つの細胞内ドメインそれぞれへの変異導入がいずれもその特徴的な遅い脱活性化を著しく加速させることを見出してきたが、その構造機能連関には未だ不明な点が多い。
本研究では、これら4つの細胞内ドメインに焦点を当て、①これらのドメイン間で形成される相互作用の有無、また、チャネルの開・閉状態に依存した各ドメイン間相互作用の局所的な構造変化と、それに伴う主要なアミノ酸の位置関係の解明を目指す。さらに、②ゲーティングに伴うチャネル分子全体の構造変化における各ドメイン間相互作用の役割と、それに基づく遅い脱活性化の制御機構との関係性を解明すべく、FRETを用いた解析を計画している。
これら①と②の解析について、昨年度より本格的な解析を開始しており、本年度でもそれらの解析を継続してきた。しかし、主として使用しているパッチクランプ法での解析について、培養細胞におけるhERGチャネルの発現量等に改善が必要となり、そのために新しい培養細胞の準備や実験機器のアップグレード等を試し、解析環境の改善に努めることとなった。その他、昨年度に引き続き、本研究計画の解析手法等を応用することにより、hERGチャネルに対する薬剤や細胞内イオン組成の影響に関する解析も実施しており、これらの解析によって得られた結果は、論文や学術大会で発表するに至っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では、hERGチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指し、Non-domain swapped構造に伴い膜貫通領域直下に集中して配置されている特徴的な4つの細胞内ドメインに焦点を当て、「研究実績の概要」で上述した①および②の解析を計画している。
①に関しては、4つの細胞内ドメインに存在する任意のアミノ酸をシステインに置換し、それらを組み合わせたシステイン二重変異体を作製した後、膜電位固定下で酸化剤添加を添加した際のジスルフィド結合形成の過程を電流の変化としてパッチクランプ法により解析する。これまでに、各部位のアミノ酸のシステイン変異体の作製を完了させ、いくつかのアミノ酸に関しては、システイン以外のアミノ酸に置換した変異体も作製し、アミノ酸の種類による表現型の変化等の解析も開始している。しかし、培養細胞におけるhERGチャネルの発現量が低く電流量が少ない等の課題が残っていたため、その改善が必要になった。本年度は初めに、hERGチャネルの電流量を増加させ、より詳細な解析を可能にするため、プラスミド上のコザック配列の見直しや、より高い発現量が期待できるHEK293T細胞への切り替えなどを実施した。また、パッチクランプアンプのアップグレード等も行い、計画の遂行に努めているが、申請時の研究実施計画からは遅れており、そのため来年度への期間延長を申請するに至った。
②に関しては、膜貫通領域と細胞内ドメインそれぞれに蛍光タンパク質（CFPとYFP）を融合させた変異体を作製し、分子構造の変化をCFP-YFP間のFRET効率の変化として解析する。こちらは初年度より顕微鏡の準備を開始しており、昨年度までにおおよその準備を完了させている。しかし、年度途中に分子生物学的な準備に使用する微量高速冷却遠心機が故障する等の理由により、こちらにも遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は今後とも、hERGチャネル独自のNon-domain swapped構造と、それに起因する4つの細胞内ドメインの相互作用等の位置的な関係性に焦点を当て、このチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指す。
本年度の研究では、「現在までの進捗状況」にて上述したように、①と②の実験・解析に関して、プラスミド上のコザック配列の見直しや、より高い発現量が期待できるHEK293T細胞への切り替えなどを実施した。その他、パッチクランプ法に使用しているパッチクランプアンプのアップグレードや、微量高速冷却遠心機の購入等、環境の改善を進めた。次年度では、これらの解析の完了を目標に、ゲーティングに伴うチャネル分子全体の構造変化における各ドメイン間相互作用の役割と、それに基づく遅い脱活性化の制御機構との関係性の解明を目指す。また、得られた結果をまとめ、論文としての発表、または学術大会での発表を考えている。
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