脊髄小脳変性症でのPKCリン酸化を介した神経保護機構の解明と新規治療法への応用

• Project/Area Number: 21K06801
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 48030:Pharmacology-related
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 白藤 俊彦 神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (30595765)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上山 健彦 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 教授 (80346254)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 脊髄小脳変性症 / リン酸化 / PKC / リン酸化プロテオーム

Outline of Research at the Start

脊髄小脳変性症(SCA)は小脳プルキンエ細胞変性を起こす疾患である。
SCA1, 2, 14のモデル動物やヒトの小脳においてPKCのリン酸化が亢進し、このことが小脳プルキンエ細胞保護作用を持つことが近年示唆されている。
そこで、このPKCリン酸化の基質を網羅的リン酸化プロテオームを用いて同定し、その下流シグナルを解析する。同定したPKCリン酸化シグナルを標的としたSCAに共通して適用できる治療法開発へつなげる。

Outline of Annual Research Achievements

脊髄小脳変性症(SCA)患者の小脳プルキンエ細胞ではProtein kinase C (PKC)リン酸化亢進が共通して起こり、小脳プルキンエ細胞保護的に働くことが報告されている。本研究の目的はSCAでリン酸化が亢進するPKCリン酸化基質やそのシグナル経路を同定し、そのPKCリン酸化経路を同定し、それをターゲットにした数多くのSCAに共通して適用できる新規治療法を開発することである。本年度は、前年度に同定したVCP, PLEKHG4のリン酸化欠損・模倣変異体を用いた機能解析を行った。
１．VCP, PLEKHG4のリン酸化欠損・模倣変異体を整備した。
２．VCPについては、siRNAでノックダウンを行い、cleaved.caspase 7, cleaved. PARPなどのアポトーシスが増加することを同定した。また、ミトコンドリア機能障害のマーカーであるGDF15の増加も確認した。また、siRNAでノックダウンしたVCPをレスキューする実験を行い、これらのアポトーシス、ミトコンドリア機能障害ともに改善することを確認した。
３．PLEKHG4については、RAC1, CDC42のGEFとして働くので、これらの相互作用をリン酸化変異体を用いたRAC1, CDC42とのpull down アッセイを行った。結果的にはリン酸化欠損変異体ではRAC1, CDC42との相互作用が低下する傾向を認めた。マウスの小脳を用いた解析については、脱リン酸化酵素阻害剤の選定を行い、サンプルの脱リン酸化を防ぐ方法について検討を行い、現状よりも確実な方法を選定した。また、リン酸化プロテオームの解析方法についても、新たな試薬、手法を見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度に同定したVCP, PLEKHG4のリン酸化部位の欠損・模倣変異体を用いた解析をおこなった。その中で、VCPはターゲットになる表現型であるアポトーシスとミトコンドリア機能異常を同定した。また、リン酸化変異体のセットを用意しており、次のステップに進むところである。
PLEKHG４については、リン酸化変異体とRAC1　CDC42との相互作用のに差があることを同定した。今後、PLEKHG4のリン酸化変異体を用いてGEF活性を測定する準備も進めている。
以上のように、おおむね順調に機能解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

VCPでは、リン酸化欠損・模倣変異体を用いてこれらのリン酸化がアポトーシス、ミトコンドリア機能障害に与える影響を解析することにしている。また、今までに報告のあるリン酸化についても変異体を作製しており、これらのリン酸化のアポトーシス、ミトコンドリア機能障害に与える影響も解析する予定である。
PLEKHG４では、リン酸化欠損・模倣変異体を用いて、PLEKHG4のGEF活性を測定する予定である。また、細胞骨格の変化の解析も行う予定である。
これらのことを培養細胞を用いて行う。その後、小脳プルキンエ細胞での神経変性や形態異常などの検討を行うことでSCAにおけるPKCによるVCP, PLEKHG4のリン酸化の影響を解析する。また、マウスの小脳を用いて実際のSCAでのリン酸化の違いの解析については、SCAマウスを用いた解析に進みたいと考えている。