| Project/Area Number |
21K06825
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
平崎 正孝 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10522154)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤野 節 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70365203)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | Mbd3 / Epi幹細胞 / 中胚葉 / Brachyury遺伝子 / RNAシーケンス / ChIPシーケンス / 多能性幹細胞 / 分化の方向性 |
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| Outline of Research at the Start |
Mbd3が欠失したmES細胞は、分化刺激を与えても未分化状態を維持し続ける。未分化状態での生体移植は奇形腫の要因になる事から、申請者はMbd3によるmES細胞への分化多能性の賦与機構を解明して来た。マウス着床後胚から樹立されたEpi幹細胞は、mES細胞(Naive型)よりもヒトES細胞(Primed型)との多くの類似点から、同型と区分されている。Primed型幹細胞においてもMbd3の機能解明を行なった結果、Mbd3はNaive型とPrimed型で役割及び分子作用機序が大きく異なっている事を示唆する先行データを得た。本研究では、Mbd3によるPrimed型多能性幹細胞の維持機構の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Mbd3が欠失したmES細胞は、分化刺激を与えても未分化状態を維持し続ける。未分化状態での生体移植は奇形腫の要因になる事から、代表者はMbd3によるmES細胞への分化多能性の賦与機構を解明して来た。マウス着床後胚から樹立されたEpi幹細胞は、mES細胞(Naive型)よりもヒトES細胞(Primed型)との多くの類似点から、同型と区分されている。Primed型幹細胞においてもMbd3の機能解明を行なった結果、Mbd3はNaive型とPrimed型で役割及び分子作用機序が大きく異なっている事を示唆する先行データを得た。本研究では、Mbd3によるPrimed型多能性幹細胞の維持機構・分化の方向性を司る分子機構の解明を目指した。
ドキシサイクリン(Dox) の添加によってMbd3の発現を完全に消失できるMbd3欠失mES細胞を作製後、自動的な分化ではなく、三胚葉それぞれにプログラムされた分化を誘導した。その結果、Mbd3欠失Epi幹細胞は、内胚葉と外胚葉には分化できないが、中胚葉へ特異的に分化する事が見出された。
Mbd3欠失Epi幹細胞の方が野性型株よりも、Brachyury遺伝子の発現が誘導される結果から、中胚葉への分化時にMbd3の抑制が示唆された。しかし、野性型Epi幹細胞を中胚葉へ分化させても、Mbd3遺伝子の発現量に減少は見られなかった。この事から、Mbd3は遺伝子発現レベルで抑制を受けている可能性は低いと考えた。Mbd3タンパク質は、hES細胞でリン酸化されている事が報告されている。そこで、本研究課題では、Mbd3の推定的リン酸化部位を、グルタミン酸やアスパラギン酸に改変する事で、リン酸化模倣型変異体を作製する。このMbd3リン酸化模倣型変異体をMbd3欠失Epi幹細胞へ導入後、中胚葉へ分化誘導しBrachyury遺伝子の発現変化を調べた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当該年度において計画した、Epi幹細胞から中胚葉への分化におけるMbd3のリン酸化レベルの変化をウエスタンブロット解析で調べる為の、Mbd3の推定的リン酸化部位を認識する抗体の作製に時間がかかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Mbd3の推定的リン酸化部位を認識する抗体を作製し、Epi幹細胞から中胚葉への分化におけるMbd3のリン酸化レベルの変化をウエスタンブロット解析で調べる。さらに、着床後胚のリン酸化Mbd3の分布を免疫染色で調べ、中胚葉組織との相関を調べる。
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