「がん遺伝子DUSP4」の新規基質同定と治療応用

• Project/Area Number: 21K06888
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49020:Human pathology-related
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 守山 正胤 大分大学, 医学部, 客員研究員 (90239707)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 泥谷 直樹 大分大学, 医学部, 准教授 (80305036)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: DUSP4 / がん遺伝子 / 大腸癌 / 近位依存性ビオチン標識法 / 新規基質 / 分子標的治療

Outline of Research at the Start

Dual-specificity phosphatase 4 (DUSP4)は、MAPキナーゼを不活化するがん抑制遺伝子として広く認識されている。最近私たちは、特定の癌症例ではDUSP4が高発現していること、さらにDUSP4はがん遺伝子として機能しうることを見出した。本研究は、DUSP4の高発現によってもたらされる悪性形質（増殖能や浸潤能、治療抵抗性等）の分子メカニズムを解明して、新規の分子標的治療法の確立を目指すものである。

Outline of Annual Research Achievements

DUSP4は、がん遺伝子であるMAPキナーゼを不活化する脱リン酸化酵素として機能する。さまざまな癌腫でDUSP4の発現低下とそれに伴うMAPキナーゼの恒常的活性化が認められる。私たちは、膵癌前駆病変が浸潤性膵癌に進展する際にDUSP4の欠失と発現低下が高頻度に認められることを報告した。さらに大腸癌が深部浸潤する過程で、DUSP4が発現低下してMAPキナーゼが活性化することを報告した。
一方、癌腫によってはDUSP4が高発現しているものもあり、癌細胞の増殖能亢進や抗がん剤抵抗性、上皮間葉転換などに関わることが報告されている。私たちも大腸癌の特定の亜型では、DUSP4が高発現していること、DUSP4の発現抑制により増殖能が低下することを報告した。以上の知見に基づきDUSP4ががん遺伝子として機能する際の分子メカニズムを解明するため、近位依存性ビオチン標識 (BioID)法による新規基質の同定を試みた。
これまでに、DUSP4とビオチンリガーゼ(BirA)の融合タンパクを発現するプラスミドを構築した。次にそれをDUSP4高発現大腸癌細胞株HCT116に導入して、DUSP4-BirA融合タンパク安定発現細胞株を2株樹立した。これらの細胞株にビオチンを添加し、20時間後の細胞抽出液を電気泳動して、HRP標識ストレプトアビジンでビオチン化タンパクを確認すると、複数のバンドが検出された。目的とするDUSP4の新規基質は、これらのDUSP4-BirA融合タンパクによってビオチン化されたタンパクの中に存在することが強く示唆される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度は、ストレプトアビジンビーズを用いて細胞抽出液からビオチン化タンパクの抽出を試みた。しかし、抽出されたタンパクの濃度および総量が少なく、得られた抽出液を二次元電気泳動しても、タンパクのスポットが検出でなかった。
そこで、より高品質かつ高濃度の細胞抽出液が回収できるように実験手順を工夫した。また、タンパク回収率の高いストレプトアビジンビーズを入手して、二次元電気泳動を再試行しているところである。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通り、細胞抽出液からビオチン化タンパクをストレプトアビジンビーズで抽出する。得られた抽出液を二次元電気泳動する。ゲルから単一スポットを回収してアミノ酸分析にてタンパクを同定する。これらの中からDUSP4の新たな基質を検索する。
抽出された新規基質候補分子については、まずDUSP4高発現細胞株における新規基質の発現レベルを定量的Real-time PCR法およびWestern blot法にて解析する。
次に、siRNAを用いたノックダウン法あるいはレンチウイルスベクターを用いた強制発現法により、新規基質の発現レベルを変動させ、増殖能（MTS法）や浸潤能（Boyden chamber法）、生存能（アポトーシス解析）、細胞周期（FACS解析）への影響を調べる。さらに、新規基質が担うシグナルパスウェイを同定するために、網羅的発現解析を施行して新規基質の発現変動に伴って発現レベルが変化する遺伝子群を抽出する。得られた発現プロファイルをパスウェイ解析データベース(Ingenuity Pathway Analysis, Ingenuity Systems)に連携して、シグナルパスウェイの概要を得る。さらに、細胞タンパク液を抽出し、リン酸化タンパクアレイを用いて活性化するパスウェイを確認する。

Research Products

• [Journal Article] Efficient Establishment of Bile-Derived Organoids From Patients With Biliary Cancer. (2023)
  • Author(s): Kinoshita K, Tsukamoto Y, Hirashita Y, Fuchino T, Kurogi S, Uchida T, Nakada C, Matsumoto T, Okamoto K, Motomura M, Fukuchi S, Sagami R, Nagai T, Gotoh Y, Fukuda K, Ogawa R, Mizukami K, Okimoto T, Kodama M, Murakami K, Moriyama M, Hijiya N.
  • Journal Title: Lab Invest. Volume: 103 Issue: 6 Pages: 100105-100105
  • DOI: 10.1016/j.labinv.2023.100105
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Involvement of clusterin expression in the refractory response of pancreatic cancer cells to a MEK inhibitor. (2023)
  • Author(s): Amada K, Hijiya N, Ikarimoto S, Yanagihara K, Hanada T, Hidano S, Kurogi S, Tsukamoto Y, Nakada C, Kinoshita K, Hirashita Y, Uchida T, Shin T, Yada K, Hirashita T, Kobayashi T, Murakami K, Inomata M, Shirao K, Aoki M, Takekawa M, Moriyama M.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 114 Issue: 5 Pages: 2189-2202
  • DOI: 10.1111/cas.15735
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Enhanced phosphorylation of c-Jun by cisplatin treatment as a potential predictive biomarker for cisplatin response in combination with patient-derived tumor organoids. (2022)
  • Author(s): Tsukamoto Y, Kurogi S, Shibata T, Suzuki K, Hirashita Y, Fumoto S, Yano S, Yanagihara K, Nakada C, Mieno F, Kinoshita K, Fuchino T, Mizukami K, Ueda Y, Etoh T, Uchida T, Hanada T, Takekawa M, Daa T, Shirao K, Hironaka S, Murakami K, Inomata M, Hijiya N, Moriyama M.
  • Journal Title: Lab Invest. Volume: 102 (12) Issue: 12 Pages: 1355-1366
  • DOI: 10.1038/s41374-022-00827-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Downregulation of ZNF395 Drives Progression of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma through Enhancement of Growth Potential. (2021)
  • Author(s): Kurogi S, Hijiya N, Hidano S, Sato S, Uchida T, Tsukamoto Y, Nakada C, Yada K, Hirashita T, Inomata M, Murakami K, Takahashi N, Kobayashi T, Moriyama M.
  • Journal Title: Pathobiology Volume: 2021 Issue: 5 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1159/000514593
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Early response in phosphorylation of ribosomal protein S6 is associated with sensitivity to trametinib in colorectal cancer cells (2021)
  • Author(s): Hirashita Yuka、Tsukamoto Yoshiyuki、Kudo Y、Kakisako D、Kurogi S、Hijiya Naoki、Nakada C、Uchida T、Hirashita T、Hiratsuka T、Akagi T、Ueda Y、Shiroshita H、Etoh T、Mizukami K、Honda K、Okimoto T、Kodama M、Inomata M、Moriyama Masatsugu、Murakami K
  • Journal Title: Laboratory Investigation Volume: - Issue: 8 Pages: 1036-1047
  • DOI: 10.1038/s41374-021-00590-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ZNF395の発現低下はJNKの不活性化を介して膵癌細胞の増殖を促進する (2021)
  • Author(s): 黒木 秀作, 泥谷 直樹, 塚本 善之, 中田 知里, 猪股 雅史, 小林 隆志, 守山 正胤
  • Organizer: 第80回日本癌学会総会
• [Presentation] c-Junリン酸化亢進はシスプラチン感受性と相関する (2021)
  • Author(s): 塚本 善之, 柴田 智隆, 麓 祥一, 黒木 秀作, 平下 有香, 柳原 五吉, 矢野 信次, 中田 知里, 泥谷 直樹, 衛藤 剛, 廣中 秀一, 村上 和成, 猪股 雅史, 守山 正胤
  • Organizer: 第80回日本癌学会総会