TRIB1 promotes metastasis through transcriptional activation of EMT-related genes

Research Project

Project/Area Number	21K07095
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 50010:Tumor biology-related
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	横山隆志山梨大学, 大学院総合研究部, 特任助教 (00535833)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	TGF-β / Smad3 / TRIB1 / EMT / がん幹細胞 / C/EBPα / SMAD3 / 転移 / MAPキナーゼ経路
Outline of Research at the Start	本研究ではTGF-β/SMAD経路によって促進されるがん転移の新たな作用機序として，TRIB1によるC/EBPαの分解を介したEMT (上皮間葉転換) 関連遺伝子の転写活性化機能を明らかにすることを目的とする．私達は転写因子C/EBPαがEMT関連遺伝子の転写を抑制していることに着目し，C/EBPαの分解を誘導するアダプター因子であるTRIB1に焦点を当てた．EMT誘導におけるTRIB1の役割を調べることで，TGF-β/SMADによるがんの転移促進における新たなメカニズムの解明を行う．
Outline of Annual Research Achievements	昨年度の研究結果からTRIB1はC/EBPαの分解を介して細胞運動能やがん幹細胞性の促進に関わること考えられたため，これらの機能に関わるC/EBPα標的遺伝子の探索を行った．公的データベースにおいて，C/EBPαをノックダウンしたヒト乳がん細胞株のRNA-Seqデータセット (GSE132649) を用いて解析した結果，C/EBPαのノックダウンによりSOX2やWNT5B，β-Cateninの発現が上昇していた．そこでA549細胞とTRIB1 KO細胞にTGF-β刺激し，qPCRにより発現解析を行ったがTRIB1 KOによるこれらの遺伝子発現への影響は見られなかった． in vivoのがん転移能を調べるため，ルシフェラーゼを発現させたA549細胞とTRIB1 KOおよびTRIB1再導入細胞をそれぞれヌードマウスの尾静脈から移植し，IVISイメージングシステムによる解析を行った．移植4週間後において野生型とTRIB1再導入細胞は肺への定着が見られたが，TRIB1 KO細胞の定着は著しく減少しており，TRIB1が肺がん細胞の定着にも必須であることが示された．ヒト膵がん細胞株Panc-1においてTRIB1 KO細胞を作製したところ，A549細胞と同様にTRIB1 KOにより上皮細胞マーカーのE-cadherinタンパク質が増加した．このことから肺がんだけでなく，膵がんにおいてもTRIB1がEMTの制御に関わる可能性が考えられた．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason TRIB1 KO細胞や各変異体を再導入した細胞株を用いたin vitroの実験が概ね終了し，マウスへの移植実験によるin vivoにおけるTRIB1の重要性を示している．C/EBPα標的遺伝子の同定に至っていないため，来年度の課題である．
Strategy for Future Research Activity	細胞運動能やがん幹細胞性に関わるC/EBPα標的遺伝子を同定できていないため，作製したTRIB1 KO細胞を用いてRNA-Seqによる網羅的な遺伝子発現解析を行う．その際にMEK1/MAPキナーゼ経路の影響を最小限にするため，野生型とTRIB1 KO細胞に加えてC/EBPαと結合しないTRIB1 KR変異体導入細胞との比較が必要であると考えられる． TRIB1はTGF-β刺激によりmRNAの発現が誘導されるが，外部から発現させたTRIB1のタンパク質も増加しており，TGF-βがTRIB1タンパク質の安定化にも関与する可能性が考えられた．現在，複数の市販されている抗体を用いて検討したが内在性TRIB1を検出できなかったため，ゲノム編集によりFLAGタグを挿入して内在性TRIB1タンパク質を検出することを試みている．マウス尾静脈移植とin vivoイメージング解析では，TRIB1のMEK1と結合しない変異体やC/EBPαと結合しない変異体を再導入した細胞を同様に移植し，MAPキナーゼ経路の活性化とC/EBPα分解のがん転移能への影響を検証する．また，今回作製したPanc-1細胞をベースにしたTRIB1 KO細胞もin vitroの実験においてはA549細胞と同様の結果が得られているため，膵臓への同所移植による肺転移モデルを用いた検証も行う．