エンドソーム上でEGFRの分解・リサイクルを決定する新規分子基盤
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21K07104
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
植村 武文 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (80548925)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | メンブレントラフィック / EGFR / がん / エンドソーム / クラスリンアダプター / 細胞内小胞輸送 / クラスリン / ゴルジ体 |
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| Outline of Research at the Start |
上皮成長因子受容体EGFRのチロシンキナーゼ活性は癌病態と密接に関連する。申請者はEGFRの結合因子として、ゴルジ体・エンドソームで選別輸送因子として機能するクラスリンアダプターGGA2・AP1-γ1（γ1サブユニットを含むAP1）・AP1-γ2（γ2サブユニットを含むAP1）を同定した。また、これら3因子がエンドソームに局在する事、EGFR分解を調節する事 (EGFRの寿命決定) を見出した。本研究ではこの3因子の、EGFR取り込み、分解、リサイクルにおける機能を明らかにする。また癌細胞の挙動・腫瘍形成における関与や、癌組織における発現を解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. gamma2サブユニットを含むAP-1複合体の機能解析。AP-1複合体のgamma2サブユニットをCRISPR-Cas9システムでノックアウトした正常網膜色素上皮由来のARPE-19細胞を複数得た。ノックアウト細胞でEGFRタンパクの発現量を解析したところ、大きな影響は観察されなかった。これは以前我々が報告したgamma1ノックダウン細胞の表現型（Oncogenesis 2021）と異なるものであった事から、gamma1を含むAP-1複合体とgamma2を含むAP-1複合体とでは機能が異なる可能性が示唆された。
2. クラスリンアダプター以外の因子の解析。siRNAスクリーニングで関連因子として候補にあがった遺伝子について解析を進めた。ノックアウト細胞、ノックアウト細胞にGFP融合型遺伝子を発現させたレスキュー細胞を作製した。ノックアウト細胞ではEGFRが初期エンドソームに蓄積するのに対して、レスキュー細胞ではその表現型が戻った。今後この細胞を使用して詳細な解析を進める予定である。
3. EGFR-GFPを発現する細胞の作製。EGFR低発現細胞であるMCF7細胞にEGFR（野生型、L858R、T790M+L858R）-GFPをレンチウィルスにより導入し、それらを安定に発現する細胞を作製した。EGFR活性化はp-EGFR抗体で判定した。今後この細胞を使用し、各遺伝子のノックダウンやノックアウトを行っていく予定である。
4. 乳がん細胞株SKBR-3においてgamma1に対するshRNAをレンチウィルスにより導入し、安定にgamma1をノックダウンする細胞を作製した。この細胞ではEGFRタンパクの発現低下と増殖能低下が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
理由は以下である。
1. ノックアウト細胞を2種のセルラインで作製し、解析をスタートした。2. 解析に重要なツール、細胞を作製した。3. xenograft実験で腫瘍形成能を解析した。4. AP-1複合体のカーゴを複数見出した。5. 乳がん細胞におけるAP-1機能を解析し、論文をまとめる段階まで進んだ。6. EGFR運搬に関わる因子の同定の為、遺伝子スクリーニングを行い、複数の候補遺伝子を見出した。7. クラスリンアダプター以外の因子の解析を開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下の1～6の研究を行う。
1. ノックアウト細胞とノックダウン細胞の比較を行う。2. ノックアウト細胞、ノックダウン細胞においてレスキュー実験を行う。3. ヒト癌組織における発現解析を行う。4. EGFR運搬に関わる因子の探索を引き続き行う。5. 乳がん細胞における解析の論文化を行う。6. 新規因子の解析を引き続き行う。
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Report
(2 results)
Research Products
(9 results)
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[Journal Article] STING signalling is terminated through ESCRT-dependent microautophagy of vesicles originating from recycling endosomes.2023
Author(s)
Kuchitsu Y, Mukai K, Uematsu R, Takaada Y, Shinojima A, Shindo R, Shoji T, Hamano S, Ogawa E, Sato R, Miyake K, Kato A, Kawaguchi Y, Nishitani-Isa M, Izawa K, Nishikomori R, Yasumi T, Suzuki T, Dohmae N, Uemura T, Barber GN, Arai H, Waguri S, Taguchi T.
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Journal Title
Nature Cell Biology
Volume: 25
Issue: 3
Pages: 453-466
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] The UFM1 system regulates ER-phagy through the ufmylation of CYB5R3.2022
Author(s)
Ishimura R, El-Gowily AH, Noshiro D, Komatsu-Hirota S, Ono Y, Shindo M, Hatta T, Abe M, Uemura T, Lee-Okada HC, Mohamed TM, Yokomizo T, Ueno T, Sakimura K, Natsume T, Sorimachi H, Inada T, Waguri S, Noda NN, Komatsu M.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 13
Issue: 1
Pages: 7857-7857
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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