| Project/Area Number |
21K07105
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
堺 隆一 北里大学, 医学部, 教授 (40215603)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 神経芽腫 / チロシンリン酸化 / チロシンキナーゼ / チロシンホスファターゼ / ALKキナーゼ / PTP-RZ |
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| Outline of Research at the Start |
本研究の目的は、明らかになったALKやSrcなどのチロシンキナーゼによる神経芽腫の活性化シグナルに対して、これらの活性化シグナルと拮抗する脱リン酸化シグナルの重要性を検証することである。これまでの検討から受容体型チロシンホスファターゼPTPRZに着目し、神経芽腫におけるALKとSrcの基質群に関するこれまでの知見を用いて、PTPRZがALKシグナルとSrcシグナルの分子にどのような影響を与えるかを明らかにする。基質のリン酸化、造腫瘍能、転移能に加え、他の腫瘍でPTPRZが関与すると言われる幹細胞性についてもその影響を調べる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経芽腫におけるPTP-RZの役割を知るため、初年度に樹立したsiRNAをもちいたPTP-RZタンパク質の発現抑制の系と、クローニングしたcDNAを用いたPTP-RZタンパク質の強制発現の系を用いた系を使ってRTP-RZの発現と神経芽腫の特性の関わりに関する解析を進めてきた。今年度はPTP-RZの発現がある程度見られる神経芽腫数種で、PTP-RZと相互作用するタンパク質の解析も行ったが、用いた神経芽腫細胞ではPTP-RZの絶対的な発現量がそれほど多くないこともあり、通常の免疫沈降法では相互作用するタンパク質を明確に確認することができなかった。
そのため近年開発されたproximity-labeling法（近接ラベリング法： Roux KJ et al, J cell Biol 2012）の改良法（TurboID: Mair A et al Elife 2019）を導入して、PTP-RZの近傍にあって相互作用するタンパク質を検出する実験を開始した。TurboIDのC末付加用コンストラクトを理研バイオリソース研究センターから購入して、まず系の確立とその特異性と感受性の確認のため、これまで研究してきたALKチロシンキナーゼのC末にTurboIDを付加したコンストラクトを作成し、神経芽腫細胞株YT-nuおよびTNB-1に導入して培養中のビオチン添加によりALK近傍のタンパク質をラベルした。細胞溶出液をStreptavidinビーズにより精製し、ALK自体および結合したチロシンリン酸化タンパク質が検出される条件を確立した。現在PTP-RZのcDNAにTurboIDを付加したコンストラクトを用いて実験を継続中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍における当初の研究の立ち上がりの遅延と、神経芽腫におけるPTP-RZなどチロシンホスファターゼの絶対的な発現量が予想よりもかなり低く、そのシグナルや相互作用する分子の解析に予定より時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在PTP-RZのcDNAにTurboIDを付加したコンストラクトを用いPTP-RZの近傍に存在する主にチロシンリン酸化タンパク質を検出し、既存の抗体と質量分析法によりそれらの同定を行う。
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