| Project/Area Number |
21K07122
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藪田 紀一 大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (10343245)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | がん悪性化 / 液-液相分離 / LATS / キナーゼ / Hippo経路 / 核小体 / DNA損傷 / リン酸化 / LATSキナーゼ |
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| Outline of Research at the Start |
高分子の相分離凝集で起こる液-液相分離（LLPS）現象は、中心体や核小体などを含む非膜性細胞内小器官の形成と維持やヘテロクロマチンの形成などに重要な役割を担っており、LLPSの異常ががんを含む複数の疾病発症に関連することからその重要性が注目されている。特に最近、我々はLATS2キナーゼのリン酸化標的として核小体構成因子PHF6を新たに同定したので、本研究ではLATS1/2やそれらの標的因子群が中心体や核小体を含む非膜性細胞内小器官に集積するメカニズムとLLPSの関係を明らかにし、がん悪性化におけるLLPSの新たな機能を解明することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんを含む複数の疾病発症に関連する液-液相分離（LLPS）現象は、高分子の相分離凝集で起こるとされ、核小体や核スペックルなどの非膜性の細胞内小器官および構造体（MLOs: membraneless organelles）の形成や維持などに重要な役割を担うと考えられている。我々はこれまでに、核小体構成因子であるPHF6がLATS2キナーゼの新規のリン酸化標的であることを見出した。本研究では、UV照射におけるDNA損傷後にLATS2やPHF6を含むリン酸化標的タンパク質群が核小体などのMLOsに集積する生理的意義とLLPSとの関係を明らかにし、がん悪性化におけるLLPSの新たな機能を解明することを目指す。本年度もほぼ計画どおり順調に実験が進み以下の研究成果を得た。（１）PHF6は核小体におけるrRNA合成（リボソームRNAの転写）に関与することが報告されているので、ゲノム編集によりLATS2を欠損させた子宮頸がん由来HeLa-S3細胞株（LATS2-KO）においてFUrdの取り込み実験を行ったところ、核小体および核質におけるFUrdの取り込みは阻害された。この結果は、LATS2の機能阻害がrRNAやmRNAの転写を抑制することを示唆している。（２）LATS2の全長あるいは断片化した部分欠失変異体を蛍光タンパク質GFPとの融合タンパク質としてHeLa-S3細胞に発現させたところ、全長LATS2は細胞質で無数の点状の局在を示す一方で、部分欠失変異体は核内で点状に分布し核スペックルと共局在した。これらの点状局在は、LLPS阻害剤で消失した。これらの結果は、LLPS現象の影響下でLATS2がPHF6の転写抑制能を制御している可能性を示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LATS2はHippoシグナル経路で働く中心的なキナーゼの一つであるが、我々はこれまでにLATS2が細胞周期チェックポイントにおいても機能していることを幾つか報告してきた。その過程において、UV照射に応答して核内で特異的にリン酸化されたLATS2、PHF6、p21/CDKN1の3者がいずれも部分的に核スペックルに局在することを見出した。また、PHF6は核小体におけるrRNAの転写抑制に寄与しているとされるので、FUrd取り込み実験を行いLATS2がPHF6を制御してrRNAおよびmRNAの転写抑制を制御している可能性を見出した。一方で、UV照射後のDNA損傷に応答してLATS2が細胞質でリン酸化したp21は自己分解が促進し、caspase依存的なアポトーシスを誘導することを報告しているので（Suzuki et al., 2013）、核内でリン酸化されたp21と核スペックルの関係も明らかにして成果をまとめていく。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本研究の目的を達成して、これまでの成果をまとめていくために、不足している実験を追加することを含めて研究計画どおり推進する。がん悪性化におけるLLPSの新たな機能を解明するために、LATS1/2キナーゼあるいはそのリン酸化標的因子群（PHF6やp21）が核小体や核スペックルのような非膜性細胞内小器官（MLOs）に集積する分子メカニズムとその生理的意義を明らかにしていく。具体的には、HeLa細胞以外のがん細胞株を使用した実験やp21の分解が誘導するアポトーシスへの影響などを調べる。また、本研究の成果をまとめた論文を学術専門誌に投稿する予定であるが、その審査後の改訂（リバイス）のために要求されるであろう必要不可欠な追加実験を行っていく。
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