癌関連線維芽細胞CAFsによるミトコンドリアを介した多面的な癌悪性化機構の解明
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21K07127
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
安川 武宏 順天堂大学, 医学部, 准教授 (90646720)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | がん微小環境 / がん関連線維芽細胞 / CAFs / ミトコンドリア / がん |
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| Outline of Research at the Start |
がんというと、がん化した細胞、すなわち、がん細胞にだけ注目をしてしまいがちだが、がん・腫瘍（がん塊）は、がん細胞だけではなく非がん細胞である多様な間質細胞を含んでおり、がんはがん細胞と間質細胞の複雑なインタープレイの上に形成されている。間質細胞のうちで大きな割合を占めるがん関連線維芽細胞は、がん細胞へ様々な影響を及ぼしてがん悪性化を促進する。本研究はがん悪性化に対する理解を前進させるため、がん関連線維芽細胞とがん細胞の相互作用におけるミトコンドリアの役割に焦点をあて、癌悪性化過程でミトコンドリアにおきる変化や異常を多面的に解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
腫瘍はがん細胞だけでなく、非がん細胞である線維芽細胞、血管内皮細胞、炎症性免疫細胞などの多彩な間質細胞と共に構成されている。その中でも、がん関連線維芽細胞（cancer-associated fibroblasts; CAFs）は、後者の大きな割合を占め、サイトカイン等を放出してがん悪性化を促進している。当該分野の研究の発展によって、CAFsとがん細胞のがん微小環境における相互作用が非常に複雑であること明らかになってきており、この相互作用をより深く理解することはがん研究において欠かせない課題の１つである。本研究では、CAFsとがん細胞の相互作用におけるミトコンドリアの役割に注目し、特に細胞間でのミトコンドリアの受け渡し、ミトコンドリアトランスファーという特異な現象に焦点をあてている。ミトコンドリアトランスファーは、がん細胞の悪性化に重要な役割を果たしていると推測できるが、その役割やメカニズムはまだ充分に理解されてない。そこで、本研究ではミトコンドリアトランスファーががん細胞に及ぼす影響を多層的に解析し、また、その分子メカニズムを明らかにするために、所属講座のこれまでの研究で用いてきたヒト正常乳腺細胞を大元にして実験的に確立されたCAFs（expCAFsとよぶ）と対照線維芽細胞（exp-counterpart fibroblasts; expCPFsとよぶ）のそれぞれ１細胞株を用いて研究を進めてきた。expCAFsとexpCPFsのミトコンドリアを蛍光標識し、これらの線維芽細胞と乳がん細胞を共培養する実験系を確立し、線維芽細胞から癌細胞へのミトコンドリアトランスファーを検討したところ、expCAFsのミトコンドリアはがん細胞へトランスファーされる一方、expCPFsからはトランスファーされないという興味深い差異を示唆する結果を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
expCAFs株とexpCPFs株をそれぞれがん細胞と混合して、重度免疫不全マウスの皮下に移植して腫瘍の成長を追跡したところ、expCAFsが強い腫瘍増殖促進能を備えていることが確認された。また、遺伝子発現の網羅的な比較解析をRNA-seqを用いて行い、２細胞間で発現量に大きな差がある遺伝子を多数確認した。腫瘍増殖促進能にミトコンドリアがどのように関わっているかを探索するために、細胞外フラックスアナライザーを用いてミトコンドリア呼吸活性の指標となる酸素消費速度（OCR）を測定したところ、expCPFsに比べてexpCAFsでOCRの減少がみられた。一方、定量的PCRによってmtDNAのコピー数、mtDNAにコードされた呼吸鎖酵素複合体サブユニットのmRNA量を定量したところexpCAFsで増加傾向がみられ、これらはOCR減少に対する代償的反応の結果と推定された。これら一連の結果は、本研究で用いているexpCAFsとexpCPFsでミトコンドリアの状態に違いがあることを示していると推定できる。そして、これらの線維芽細胞からがん細胞へのミトコンドリアトランスファーを評価するため、ミトコンドリア内部に局在するように工夫された蛍光タンパク質をコードしたプラスミドをこれらの細胞にトランスフェクションして効率よく発現させる実験条件を至適化した。そして、これらexpCAFsとexpCPFsをがん細胞と混合して共培養し、蛍光顕微鏡で観察を行なったところ、expCAFsからがん細胞へのミトコンドリアトランスファーが起きることを見出した。一方で、expCPFsからはミトコンドリアトランスファーが起きない。All or noneとも言ってよいようなこの結果は予想外であったが、今後さらに実験系を洗練させて検証を重ねて研究を発展させる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１） まず、ミトコンドリアトランスファーの実験条件を最適化し、expCAFsとexpCPFsのトランスファー効率を定量的に明らかにする。ところが、現在利用しているトランスフェクション法はexpCAFs細胞へのダメージが大きく、定量的な解析が困難である。そこで、トランスフェクション法ではなく、不活化ウイルスベクター遺伝子導入系を用いて高効率に、低細胞障害性に、ミトコンドリア局在蛍光タンパク質の発現系を導入できるよう、現在、実験系に大幅な改良を加えているところである。
（２） （１）を達成するとミトコンドリア局在蛍光タンパク質が恒常的に発現するexpCAFsとexpCPFsの作成ができることにもなる。そこで、これらの細胞とがん細胞を混合して免疫不全マウスへ皮下移植して腫瘍を形成させ、腫瘍を摘出し細胞を抽出してがん細胞を観察し、in vivoの系でミトコンドリアトランスファーがおきるのか否かを検討する。
（３） In vitro, in vivoでミトコンドリアトランスファーを受けたがん細胞の細胞増殖力や浸潤力、また、転移に関与する上皮間葉転換や抗がん剤耐性などを検討し、がん細胞に対するトランスファーの効果を明らかにする。
（４） 本研究課題で確立したミトコンドリアトランスファーの実験系を用いて、その分子メカニズムを明らかにする。そして、例えばミトコンドリア機能の障害などを人工的に加え、どのような処理によってトランスファーが阻止できるかを検討することから、CAFsの癌悪性化促進能の阻害を、ミトコンドリアトランスファーを抑制することで実現するというアプローチで検討し、新規の治療方策の開発につなげたい。
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Report
(2 results)
Research Products
(9 results)
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[Journal Article] TFB2M and POLRMT are essential for mammalian mitochondrial DNA replication2022
Author(s)
Inatomi Teppei、Matsuda Shigeru、Ishiuchi Takashi、Do Yura、Nakayama Masunari、Abe Shusaku、Kasho Kazutoshi、Wanrooij Sjoerd、Nakada Kazuto、Ichiyanagi Kenji、Sasaki Hiroyuki、Yasukawa Takehiro、Kang Dongchon
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Journal Title
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research
Volume: 1869
Issue: 1
Pages: 119167-119167
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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