骨肉腫の腫瘍免疫誘導制御に関わる分子機構解明と新規がん免疫療法の開発
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21K07134
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Hoshi University |
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Principal Investigator |
清水 孝恒 星薬科大学, 薬学部, 准教授 (40407101)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 骨肉腫 / 腫瘍免疫 / 転移巣 / がん微小環境 / 血管新生 |
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| Outline of Research at the Start |
骨肉腫は未だ予後不良であり、治療標的分子は解明されておらず、既存の免疫療法も大きな奏功を示さない。このため、難治例に対する新規治療法開発が求められる。本研究は、独自のマウスモデルと評価系を用いて、骨肉腫の腫瘍免疫誘導制御に関わる分子機構の解明を目的とする。これまで骨肉腫細胞にsgRNA libraryを導入したのち、B6野生型とSCIDマウスに移植し、腫瘍内残存sgRNAをNGS解析により比較した。発現差のある候補遺伝子の中から腫瘍形成能に関わるヒット分子を同定したのち、分子機構を解明し、骨肉腫に対する新規免疫療法の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に続きdropout screeningから抽出された遺伝子に関し、骨肉腫細胞にshRNAによるノックダウンを行い、C57BL/6（B6）と免疫不全のC57BL/6 SCID（B6scid）マウスに移植し、腫瘍形成能の比較を行った。昨年度検証した遺伝子はいずれも、B6とB6scid間でみられる腫瘍形成の差は小さかった。そこで、検証する遺伝子の幅を広げ、候補遺伝子の上位に位置するのミトコンドリア内の電位依存性アニオンチャネル及び、ATP依存性プロテアーゼに関し評価を行った。しかし、腫瘍形成への影響は見られなかった。現在、抽出法の改良と評価を行うタイミングの検討を行っている。
抽出された遺伝子群は、過去の報告からp53と関連が示唆された。そこで、AXT細胞でみられる変異p53の腫瘍免疫への関与を解析した。変異は一塩基置換によりアミノ酸置換R270Cがおこっていた。変異p53をCRISPR-Cas9によりノックアウト（KO）し、親株AXT細胞と変異p53をノックアウトした細胞をB6マウスに移植した結果、KO細胞由来の骨肉腫は親株由来に比較して小さかった。一方で、B6scidマウスに移植した結果と比較すると、親株由来の腫瘍重量を1として、KO細胞では1.5から4倍大きな腫瘍の形成がみられた。即ち、変異p53は、腫瘍免疫を抑制する可能性が示唆されたが、検討中である。一方、変異p53は細胞増殖を促進したが、浸潤、in vivoにおける転移能には影響を与えなかった。変異p53は野生型が有する転写活性を示さなかった。ChIP assayの結果、変異p53はDNAには結合するものの、DNA傷害時に転写活性に必要とされる結合部位には野生型p53と比較して結合量が少ないことが明らかとなった。以上の変異p53の生物学的意味、分子機構に関する知見は海外誌に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
dropout screeningにより骨肉腫腫瘍免疫に関連が示唆される候補遺伝子に関して、in vivoの検証から真に腫瘍免疫に関与する分子を抽出するプロセスは正確に行えている。しかしながら、昨年度に続き、現在までのところ検証した分子は、in vivoで大きな腫瘍形成能の変化をもたらしていない。引き続きこの解析は継続するものの、dropout screeningからの情報のみでは短期でヒット遺伝子にたどり着けない可能性も示唆される。そこで、in vivoでAXT細胞に比較して腫瘍形成能の低い骨肉腫細胞AX細胞とAX細胞由来の骨肉腫（B6マウス、B6 scidマウスの両方）の遺伝子発現プロファイルを併用し、再度候補分子の抽出を行っている。その過程から、線維芽細胞増殖因子ファミリーに属する分子が候補として上がり、CRISPR-Cas9によりKO細胞を作成した。in vitroでの細胞増殖はcontrol細胞に比較して低下していた。B6マウスに移植した結果、KO細胞はほとんど腫瘍形成能をもたないことが明らかとなった。現在、その分子機構が腫瘍免疫に依存するものか検証を進めている。
さらに、昨年度から課題として浮き彫りとなった、T細胞が腫瘍に多く見られる、より腫瘍形成の早期に評価を行うタイミングを検討も行っている。候補となる分子の抽出、現在候補として上がった分子の分子機構解明とともに、結果の進捗状況を踏まえて、解析手法を変えてゆく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
・候補遺伝子の骨肉腫形成における影響評価：前年度に引き続き、dropout screeningの結果に加え、効率よくヒット遺伝子を抽出するための判断材料として腫瘍形成能の異なる細胞の遺伝子発現プロファイルを用いる。候補遺伝子に関して、骨肉腫細胞（AXT）に候補遺伝子の発現修飾を行い、B6とB6scidマウスへ移植後、腫瘍形成能を比較する。腫瘍形成早期の評価を追加して検証する。
上記過程から腫瘍免疫への関与が濃厚な遺伝子（2022年度抽出されたFgfファミリー遺伝子を含める）には以下の実験を進め分子機構を解明し、創薬の可能性を検討する。
・腫瘍免疫制御に関わる分子機序の解明：＜腫瘍サンプルの解析＞：組織から切片を作成し、免疫組織染色法により組織学的違いを見出す。mock細胞 vs修飾細胞移植群、B6 vs B6scid移植群を比較し、特に、腫瘍内の免疫細胞の種類・数、腫瘍血管構築、細胞死の差異に注目する。定量的解析は腫瘍から細胞浮遊液を作成し、flow cytometryで解析する。
＜in vitroの解析＞：１．細胞内因性因子の評価：細胞増殖、細胞死、細胞周期を解析し、遺伝子発現修飾による影響を調べる。これらへの影響がみられず、in vivoのみで腫瘍抑制効果がみられる場合は、環境因子による機序の可能性が高い。また、親株との間で網羅的遺伝子発現比較を行い、責任分子、シグナル伝達経路同定の一助とする。２．責任シグナル経路の同定、分子機構の解明：ヒット分子の上流、下流で働く分子が示唆された場合、ノックダウン、過剰発現により、in vivo形質変化への役割を解明する。マウスへ投与可能な阻害薬が存在する場合は、抗腫瘍効果を検討する。
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Report
(2 results)
Research Products
(9 results)
