銀ナノ錯体バイオチップを活用したヌクレオソーム解析による新規大腸癌診断法の確立

• Project/Area Number: 21K07181
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 金城 達也 琉球大学, 病院, 講師 (50623386)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 士郎 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50314159)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2021: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
• Keywords: 銀ナノ錯体バイオチップ / ヌクレオソーム / エピジェネティック / 次世代シーケンサー / 大腸癌

Outline of Research at the Start

大腸癌はスクリーニング法が煩雑であり、沖縄県では検診率が低く、進行癌の診断率が高い。その結果、大腸癌死亡率が非常に高い。近年、リキッドバイオプシー研究が急速に発達している．さらに癌研究分野では、エピジェネティクス解析の点においてもヌクレオソームが注目されている。私達は銀ナノ錯体バイオチップを用いた血中癌細胞由来ヌクレオソーム検出による簡便かつ迅速な大腸癌診断の研究を蓄積してきた。大腸癌の発癌・進行過程と血中ヌクレオソームに付帯する癌遺伝子及びエピジェネティック変化について，本研究では銀ナノ錯体バイオチップを活用し、新規大腸癌スクリーニング法の確立及び臨床応用にも追究する。

Outline of Annual Research Achievements

大腸癌のスクリーニング法が現状では煩雑であり、また沖縄県では検診及び精検受診率も極めて低く、進行癌の診断率が高い。その結果、大腸癌死亡率が非常に高く、島嶼県、高齢者及び併存疾患保有率の急増など、沖縄県特有の背景が拍車をかけている。近年、核酸解析によるリキッドバイオプシー研究が急速に発達しているが、未だ解析精度の点で課題が多い。癌研究分野では、エピジェネティクス変化も網羅する新たな指標として、血中ヌクレオソームが注目されている。これまでに銀ナノ錯体バイオチップを使用し、血中癌細胞由来ヌクレオソーム検出による簡便かつ迅速な大腸癌診断の研究を蓄積してきた。大腸癌の発癌・進行過程と血中ヌクレオソーム及び付帯する癌遺伝子及びエピジェネティック変化には、どのような関連があるのか？本研究では銀ナノ錯体バイオチップを活用し、ヌクレオソーム解析及び沖縄県内で実証試験を実施し、新規大腸癌スクリーニング法の確立及び臨床応用にも追究する。令和4年は銀ナノ錯体バイオチップ捕捉塩基配列解析と手術患者を対象としたレジストリ作成を継続。銀ナノ錯体バイオチップにより捕捉されたヌクレオソームの自家発光波長による癌診断とDNA塩基配列の解析を実施。捕捉血清癌由来ヌクレオソーム検出のため、特定波長を使用し、蛍光物質の面積値を測定し、Ratio値のカットオフ値を決定し、さらに捕捉血清癌由来ヌクレオソームからDNAを抽出し、抽出される微量DNAの精製および増幅の条件について検討を行い、次世代シークエンサーを用いてDNA塩基配列を行い、特徴を捉える。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和4年は、銀ナノ錯体バイオチップ捕捉塩基配列解析及びエピジェネティック解析と手術患者を対象としたレジストリ作成を継続。銀ナノ錯体バイオチップにより捕捉されたヌクレオソームの自家発光波長による癌診断とDNA塩基配列解析を実施。マイテック社での技術改良後の新解析機器を用いた再検討にて、捕捉された血清癌由来ヌクレオソームに対して２種類の既知の特定波長を使用し、蛍光物質の面積値及びそのRatio値、カットオフ値を決定した。大腸癌病期分類との相関性を検証したが、病期別患者数の偏りが大きく、症例をさらに集積し、大腸癌病期分類の相関性の検証を継続していく。捕捉された血清癌由来ヌクレオソームについて、これまでの研究ではバイオチップから化学的変性によるDNA抽出をおこなっていたが、ssDNAの抽出しかおこなえず、遺伝子解析の実施が困難であった。しかし、今回は物理的破壊をおこなうことでdsDNAを抽出することが可能となった。バイオチップの特性上、回収できたdsDNAが微量であったため、DNA解析まで時間を要したが、抽出dsDNAの精製・増幅を条件設定し、次世代シークエンサーによる解析に至った。遺伝子解析の結果、Stage I粘液腺癌症例における上皮間葉転換関連遺伝子であるCadherin 13のvariantおよびStage IV症例におけるがん抑制遺伝子であるthyroid hormone receptor betaのvariantなど、段階的がん進展に関連する遺伝子が検出された。銀ナノ錯体バイオチップにより補足されたcfDNAは、本研究の対象症例においてはがん診断率が高く、補足遺伝子はがん進展の特徴を捉えることが可能である可能性が示唆された。この研究成果を第82回日本癌学会学術総会に投稿中である。

Strategy for Future Research Activity

銀ナノ錯体バイオチップが捕捉したヌクレオソーム由来遺伝子の解析症例数を増やして病期別に臨床データとの関連性を検討し、同時にDNAメチル化解析も開始する予定である。令和４年度から症例登録施設が追加となったため、今後もさらに症例登録が進む予定であり、レジストリ作成は今後も順調に実施可能である。これらのデータを使用し、関連性を検討することで、早期癌診断、遺伝子パネル解析の作成に取り組むことが可能と考えている。その結果を発展させ、個別化診断及び治療への応用を検討していく。さらに銀ナノ錯体バイオチップを用いて検診受診者及び診療所通院中患者における大腸癌スクリーニング検査をおこない大腸癌診断法としての有用性を検証していく。