Development of disease-modifying therapy for spinocerebellar ataxia type 42 and elucidation of pathophysiological basis using optogenetic methods

• Project/Area Number: 21K07298
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 51030:Pathophysiologic neuroscience-related
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 土井 宏 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (10326035)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹内 英之 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (30362213) ; 田中 章景 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (30378012) ; 石川 太郎 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (50547916) ; 國井 美紗子 横浜市立大学, 医学研究科, 客員講師 (80725200)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: CACNA1G / 脊髄小脳変性症 / 光遺伝学 / カルシウムチャネル

Outline of Research at the Start

申請者らはCACNA1Gのバリアントに起因するSCA42の表現型を再現するバリアントノックインマウス（Cacna1g_R1723H_KIマウス）を作成し、本モデルマウスが緩徐進行性の失調症状、プルキンエ細胞の変性、電気生理学的異常を呈することを示してきた。本研究ではCacna1g_R1723H_KIマウスを用いてSCAの新たな疾患修飾治療法を開発すること、また光遺伝学的手法を用いて神経変性の病態基盤をin vivoのレベルで解明することを目的とし、T型カルシウムチャネル修飾薬投与実験および電気生理学的解析を施行する。

Outline of Annual Research Achievements

申請者らは研究対象としてきた常染色体優性脊髄小脳失調症（SCA）大家系において、新型DNAシーケンサーを用いて低電位活性化型のT型電位依存性カルシウムチャネル（VGCC）の一種であるCaV3.1をコードするCACNA1Gのミスセンスバリアント、p.Arg1715His（R1715H） を同定した。単一アミノ酸のミスセンスバリアントであるR1715Hにより実際に神経変性が惹起されるかは不明であり、申請者らはその証明には動物モデルの作成が必須であると考え、R1715Hと同等のR1723HバリアントをCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により導入したノックインマウス（Cacna1g_R1723H_KIマウス）を作成した。これまでに申請者らは構造モデリング、ヒト病理検体解析、培養細胞実験を継続するとともにCacna1g_R1723H_KIマウスの多面的解析を行い、このバリアントによるタンパク質凝集性には変化がないこと、行動解析において患者と同様の緩徐進行性の失調症状を示すこと、プルキンエ細胞（PC）の進行性変性を呈すること、PCおよび下オリーブ核神経細胞がカル
シウム電流異常を含む電気生理学的異常を呈することを示し、SCA42の表現型を良好に再現するモデルを確立してきた。本研究ではCacna1g_R1723H_KIマウスにT型VGCC修飾薬の投与を行い、その効果を表現型解析、病理学的解析、RNA発現解析など多面的に検証することにより、新たな疾患修飾治療法を開発し疾患克服への道筋をつけること、また光遺伝学的手法を用いて神経変性の病態基盤をin vivoのレベルで解明することを目的としている。昨年度の時点で表現型解析、病理学的解析においてT型VGCC修飾薬の効果を認めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は下記のような計画のもと、おおむね順調に進展している。
①Cacna1g_R1723H_KIマウスにおけるVGCC機能修飾薬の治療効果の検討：疾患発症機序がgain-of-toxic-functionであるとの立場からはT型VGCC阻害薬で治療効果を検討している。現時点で50週齢まで野生型、ヘテロおよびホモノックインマウスにT型VGCC阻害薬を経口投与を終えRotarodテストで失調改善効果を認め、本年度は病理学的解析でも変性抑制効果を確認できたため、順調に進行している。
②Cacna1g_R1723H_KIマウスのRNA発現解析：50週齢のSCA42マウス（野生型、ヘテロ KI、ホモ KI）各3匹ずつの小脳からRNAを抽出し、網羅的に解析した。Log Fold ChangeとLog P. valueをもとに、発現変動遺伝子を検索しVolcano plotとHeatmapで可視化を行った。野生型と比して低下している発現遺伝子は、ヘテロKIで19個、ホモKIでは33個認められ、野生型と比して上昇しているものはヘテロKIで13個、ホモKIでは26個認められた。
③Cacna1g_R1723H_KIマウスのin vivo PCにおける電気生理学的解析と治療効果の検証：プルキンエ細胞特異的にチャネルロドプシン２（ChR2）を発現するトランスジェニックマウスとCacna1g_R1723H_KIを掛け合わせ、用いて、光照射によりプルキンエ細胞を簡易に同定できるモデルを採用した。現在、データ取得中である。ただし、ChR2発現のプルキンエ細胞特異性が悪い、という問題点が生じている。

Strategy for Future Research Activity

①Cacna1g_R1723H_KIマウスにおけるVGCC機能修飾薬の治療効果の検討：T型VGCC阻害薬の単一濃度で研究を進めて行くことが妥当かどうかについて検証するため、ゾンデによるT型VGCC阻害薬の投与により、より血中濃度を高めた場合の効果について検討する予定である。
②Cacna1g_R1723H_KIマウスのRNA発現解析：今後より若年マウスのRNAシーケンスも検討する。
③Cacna1g_R1723H_KIマウスのin vivo PCにおける電気生理学的解析と治療効果の検証：現行のマウスでは、ChR2がプルキンエ細胞以外の細胞でも非特異的に発現している可能性が否定できない。より特異性の高いL7-Creマウスを入手できたため、今後はこの系統を使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Reduced likelihood of the Poggendorff illusion in cerebellar strokes: a clinical and neuroimaging study (2023)
  • Author(s): Yuichi Higashiyama・・・Hiroshi Doi, et al.
  • Journal Title: Brain Communications Volume: 5 Issue: 2
  • DOI: 10.1093/braincomms/fcad053
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Anti-inflammatory effects of siponimod on astrocytes (2022)
  • Author(s): Akihiro Ogasawara, ・・Hiroshi Doi, Fumiaki Tanaka
  • Journal Title: Neuroscience Research Volume: 184 Pages: 38-46
  • DOI: 10.1016/j.neures.2022.08.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rapid and comprehensive diagnostic method for repeat expansion diseases using nanopore sequencing (2022)
  • Author(s): Satoko Miyatake, Eriko Koshimizu, Atsushi Fujita, Hiroshi Doi, et al.
  • Journal Title: npj Genomic Medicine Volume: 7 Issue: 1 Pages: 62-62
  • DOI: 10.1038/s41525-022-00331-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phosphorylated CRMP1, axon guidance protein, is a component of spheroids and is involved in axonal pathology in amyotrophic lateral sclerosis (2022)
  • Author(s): Yuko, Kawamoto・・・Hiroshi Doi, et al.
  • Journal Title: Frontiers in Neurology Volume: 13 Pages: 994676-994676
  • DOI: 10.3389/fneur.2022.994676
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Patients with biallelic GGC repeat expansions in NOTCH2NLC exhibiting a typical neuronal intranuclear inclusion disease phenotype (2022)
  • Author(s): Shinichi Kameyama, Takeshi Mizuguchi, Hiroshi Doi, et al.
  • Journal Title: Genomics Volume: 114 Issue: 5 Pages: 110469-110469
  • DOI: 10.1016/j.ygeno.2022.110469
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ocular flutter as the presenting manifestation of autoimmune glial fibrillary acidic protein astrocytopathy (2022)
  • Author(s): Taishi Wada・・・Doi Hiroshi Doi, et al.
  • Journal Title: Clinical Neurology and Neurosurgery Volume: 219 Pages: 107307-107307
  • DOI: 10.1016/j.clineuro.2022.107307
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ultrasonographic evaluation reveals thinning of cervical nerve roots and peripheral nerves in spinal and bulbar muscular atrophy (2022)
  • Author(s): Daisuke Watanabe, Hiroshi Doi, et al.
  • Journal Title: Neurological Sciences Volume: 43 Issue: 7 Pages: 4267-4274
  • DOI: 10.1007/s10072-022-05969-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Parallel Appearance of Polyglutamine and Transactivation-Responsive DNA-Binding Protein 43 and Their Complementary Subcellular Localization in Brains of Patients With Spinocerebellar Ataxia Type 2. (2022)
  • Author(s): Koyano S, Yagishita S, Tada M, Doi H, Uchihara T, Tanaka F
  • Journal Title: JOURNAL OF NEUROPATHOLOGY AND EXPERIMENTAL NEUROLOGY Volume: - Issue: 7 Pages: 535-544
  • DOI: 10.1093/jnen/nlac032
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibition of Crmp1 phosphorylation at Ser522 ameliorates motor function and neuronal pathology in amyotrophic lateral sclerosis model mice (2022)
  • Author(s): Asano Tetsuya、Nakamura Haruko、Kawamoto Yuko、Tada Mikiko、Kimura Yayoi、Takano Hiroshi、Yao Ryoji、Saito Hiroya、Ikeda Takuya、Komiya Hiroyasu、Kubota Shun、Hashiguchi Shunta、Takahashi Keita、Kunii Misako、Tanaka Kenichi、Goshima Yoshio、Nakamura Fumio、Takeuchi Hideyuki、Doi Hiroshi、Tanaka Fumiaki
  • Journal Title: eneuro Volume: - Issue: 3 Pages: 0133-22
  • DOI: 10.1523/eneuro.0133-22.2022
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Repeat conformation heterogeneity in cerebellar ataxia, neuropathy, vestibular areflexia syndrome (2022)
  • Author(s): Miyatake S, Yoshida K, Koshimizu E, others, Miyake N, Shimohata T, Tanaka F, Mizuguchi T, Matsumoto N.
  • Journal Title: Brain Volume: 145 Issue: 3 Pages: 1139-1150
  • DOI: 10.1093/brain/awab363
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biallelic expansion in RFC1 as a rare cause of Parkinson’s disease (2022)
  • Author(s): Kytovuori Laura、Sipila Jussi、Doi Hiroshi、Hurme-Niiranen Anri、Siitonen Ari、Koshimizu Eriko、Miyatake Satoko、Matsumoto Naomichi、Tanaka Fumiaki、Majamaa Kari
  • Journal Title: npj Parkinson's Disease Volume: 8 Issue: 1 Pages: 6-6
  • DOI: 10.1038/s41531-021-00275-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Hornerin deposits in neuronal intranuclear inclusion disease: direct identification of proteins with compositionally biased regions in inclusions (2022)
  • Author(s): Park Hongsun、Yamanaka Tomoyuki、Toyama Yumiko、Fujita Atsushi、Doi Hiroshi、Nirasawa Takashi、Murayama Shigeo、Matsumoto Naomichi、Shimogori Tomomi、Ikegawa Masaya、Haltia Matti J.、Nukina Nobuyuki
  • Journal Title: Acta Neuropathologica Communications Volume: 10 Issue: 1 Pages: 28-28
  • DOI: 10.1186/s40478-022-01333-8
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (2021)
  • Author(s): Komiya Hiroyasu、Takeuchi Hideyuki、Ogawa Yuki、Suzuki Kosuke、Ogasawara Akihiro、Takahashi Keita、Azuma Yasu-Taka、Doi Hiroshi、Tanaka Fumiaki
  • Journal Title: Molecular Brain Volume: 14 Issue: 1 Pages: 74-74
  • DOI: 10.1186/s13041-021-00785-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Complete sequencing of expanded SAMD12 repeats by long-read sequencing with Cas9-mediated enrichment. (2021)
  • Author(s): Mizuguchi T, Toyota T, Miyatake S, Mitsuhashi S, Doi H, Kudo Y, Kishida H, Hayashi N, Tusburaya RS, Kinoshita M, Fukuyama T, Fukuda H, Koshimizu E, Tsuchida N, Uchiyama Y, Fujita A, Takata A, Miyake N, Kato M, Tanaka F, Adachi H, Matsumoto N.
  • Journal Title: Brain Volume: 144 Issue: 4 Pages: 1103-1117
  • DOI: 10.1093/brain/awab021
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Therapeutic efficacy of heparin and direct factor Xa inhibitors in cancer-associated cryptogenic ischemic stroke with venous thromboembolism (2021)
  • Author(s): Yamaura Genpei、Ito Takeshi、Miyaji Yosuke、Ueda Naohisa、Nakae Yoshiharu、Momoo Takayuki、Nakano Tatsu、Johmura Yuji、Higashiyama Yuichi、Joki Hideto、Doi Hiroshi、Takeuchi Hideyuki、Takahashi Tatsuya、Koyano Shigeru、Yamaguchi Shigeki、Yokoyama Mutsumi、Tanaka Fumiaki
  • Journal Title: Thrombosis Research Volume: 206 Pages: 99-103
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2021.08.016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular epidemiology of hereditary ataxia in Finland (2021)
  • Author(s): Lipponen Joonas、Helisalmi Seppo、Raivo Joose、Siitonen Ari、Doi Hiroshi、Rusanen Harri、Lehtilahti Maria、Ryytty Mervi、Laakso Markku、Tanaka Fumiaki、Majamaa Kari、Kytovuori Laura
  • Journal Title: BMC Neurology Volume: 21 Issue: 1 Pages: 382-382
  • DOI: 10.1186/s12883-021-02409-z
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Father-to-offspring transmission of extremely long NOTCH2NLC repeat expansions with contractions: genetic and epigenetic profiling with long-read sequencing (2021)
  • Author(s): Fukuda H, Yamaguchi D, Nyquist K, Yabuki Y, Miyatake S, Uchiyama Y, Hamanaka K, Saida K, Koshimizu E, Tsuchida N, Fujita A, Mitsuhashi S, Ohbo K, Satake Y, Sone J, Doi H, Morihara K, Okamoto T, Takahashi Y, Wenger AM, Shioda N, Tanaka F, Matsumoto N, Mizuguchi T
  • Journal Title: Clin Epigenetics Volume: 13 Issue: 1 Pages: 204-204
  • DOI: 10.1186/s13148-021-01192-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Prenatal clinical manifestations in individuals with COL4A1/2 variants (2020)
  • Author(s): Itai T, Miyatake S, Taguri M, Nakashima M, Saitsu H, Matsumoto N et al.
  • Journal Title: J Med Genet Volume: 0 Issue: 8 Pages: 106896-106896
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2020-106896
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Ethosuximide improves clinical and pathological phenotypes of SCA42 mouse model. (2022)
  • Author(s): Shunta Hashiguchi, Hiroshi Doi, Masaki Okubo, Misako Kunii, Keita Takahashi, Mikiko Tada, Kenichi Tanaka, Hideyuki Takeuchi, Taro Ishikawa, Fumiaki Tanaka
  • Organizer: 第63回日本神経学会学術大会
• [Presentation] Ethosuximide improves clinical and pathological phenotypes of SCA42 mouse model. (2022)
  • Author(s): Masaki Okubo, Hiroshi Doi, Shunta Hashiguchi, Misako Kunii, Keita Takahashi, Mikiko Tada, Kenichi Tanaka, Hideyuki Takeuchi, Taro Ishikawa, Fumiaki Tanaka
  • Organizer: 第45回日本神経科学大会
• [Presentation] Identification of intronic repeat expansion of RFC1 by long-read sequencer. (2021)
  • Author(s): 土井宏、中村治子、宮武聡子、三橋里美、水口剛、大久保正紀、工藤洋祐、浅野徹也、國井美紗子、田中健一、多田美紀子、上木英人、竹内英之、松本直通、田中章景
  • Organizer: 第62回日本神経学会学術大会