血友病Aブタ血漿を用いたヒト凝固因子測定法の開発

• Project/Area Number: 21K07324
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52010:General internal medicine-related
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 柏倉 裕志 自治医科大学, 医学部, 講師 (40382890)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大森 司 自治医科大学, 医学部, 教授 (70382843)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 凝固因子測定 / 第VIII因子 / 血友病A / 血液凝固因子 / 血友病

Outline of Research at the Start

血友病Aは血液凝固第VIII因子(FVIII)が欠乏する先天的出血性疾患である。現在様々な血友病A治療薬が開発されているが、依然として周術期や出血時にはFVIII製剤の追加投与とFVIII活性のモニタリングが必要である。現行の測定法では追加投与したFVIIIをモニタリングできない血友病A治療薬も存在し、その解決が喫緊の課題となっている。本研究では、申請者らが開発した血友病Aブタの血漿、およびブタFVIII欠乏血漿を用いたFVIII測定法を確立する。この測定法により、血友病A治療薬に左右されることのない幅広い血友病A患者を対象としたFVIII活性の測定が可能となる。

Outline of Annual Research Achievements

血友病Aは血液凝固第VIII因子(FVIII)が欠乏する先天的出血性疾患である。現在様々な血友病A治療薬が開発されているが、依然として周術期や出血時にはFVIII製剤の追加投与とFVIII活性のモニタリングが必要である。現行の測定法では追加投与したFVIIIをモニタリングできない血友病A治療薬も存在し、その解決が喫緊の課題となっている。本研究では、申請者らが開発した血友病Aブタの血漿、およびブタFVIII欠乏血漿を用いたFVIII測定法を確立する。この測定法により、血友病A治療薬に左右されることのない幅広い血友病A患者を対象としたFVIII活性の測定が可能となる。
本年は、血友病Aマウスから抗ブタFVIIIモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
ブタFVIIIを安定発現する細胞株を樹立し、細胞上清より濃縮ブタFVIIIタンパクを分離し、FVIII活性発現とELISAにより確認した。肝臓特異的なプロモーターの下流にブタFVIIIcDNA発現するAAVベクターを作製し、血友病Aマウスヘ投与することでブタFVIII活性を阻害する中和抗体を発現するマウス個体を得た。同様に、濃縮ブタFVIIIタンパクの投与でもブタFVIII活性を阻害する中和抗体を発現するマウス個体を得た。これらブタFVIIIに対する中和抗体を発現する血友病Aマウスの脾臓から、ハイブリドーマを作製した。スクリーニングの結果、ブタFVIIIに結合するモノクローナル抗体を産生する４種のハイブリドーマを樹立することに成功した。得られたモノクローナル抗体は、立体構造認識すると推測されるクローンを除き、A1ドメイン、a3ドメイン、Cドメインに結合すると推測された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和３-４年度に予定していた主な研究計画は、モノクローナル抗体の作製とブタFVIII欠乏血漿の作製である。
このうちモノクローナル抗体の作製については達成しており、おおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

1) ブタFVIII欠乏血漿の作製：樹立した抗ブタFVIIIモノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、野生型ブタ血漿からFVIIIを除去する。FVIII活性測定、さらにELISAとウエスタンブロットによる検出によって、FVIIIの欠乏および残存を確認する。
2) 血友病Aブタの産出：血友病Aブタは出血傾向が強いため維持が困難である。そのため現在はヘテロブタとして農研機構で維持している。ヘテロブタと野生型ブタとの交配により血友病Aブタを産出させ、深麻酔下でクエン酸ナトリウム採血を行い、血友病Aブタ血漿を得る。
3) ブタFVIII欠乏血漿を用いたヒトFVIII測定法の確立：前年度の実験により得られたブタFVIII欠乏血漿、または血友病Aブタ血漿を用い、エミシズマブ存在下あるいは非存在下におけるヒトFVIII活性を測定する。測定可能なFVIII活性の下限値を評価・設定し、ヒトFVIII活性測定法を確立する。