| Project/Area Number |
21K07350
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52010:General internal medicine-related
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
石井 直仁 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (80212819)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横場 正典 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (80316942)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 糖尿病性腎症診断法 / 酸化ストレス / ミトコンドリア / リソソーム / 脂肪酸代謝 / マイトファジー / リソファジー / 尿中ミトコンドリアタンパク質 / ニトロ化タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
現在の腎症診断法は、尿タンパク質測定とGFRが用いられていますが、尿タンパク質が正常でも既に腎症が発症している糖尿病患者がいます。従って、腎症発症前糖尿病での新たな腎症診断法の確立が必要とされています。
申請者は、腎症発症前糖尿病の腎臓で、ミトコンドリアは酸化ストレス障害を受け、リソソームが関わり損傷ミトコンドリアを選択的に分解・除去するオートファジー(マイトファジー)により分解され、尿中に排泄されることを示し、またリソソーム不全と分解・排泄を予測しました。
ミトコンドリアとリソソームの品質管理システムと尿中への分解・排泄メカニズムを明らかにし、糖尿病性腎症の早期診断法確立を目指します。
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| Outline of Annual Research Achievements |
腎症発症前の糖尿病ラットの腎皮質において、酸化ストレスマーカーの3-nitrotyrosine生成亢進とミトコンドリアのニトロ化タンパク質同定により、ミトコンドリアは酸化ストレス障害を受けていることを示した。損傷ミトコンドリア蓄積は、細胞障害の原因となる可能性があり、腎機能障害を防ぐためには、損傷ミトコンドリアを分解・除去しなければならない。腎症発症前の糖尿病ラットの腎皮質において、損傷ミトコンドリアを選択的に分解・除去するマイトファジーの誘導とミトコンドリアタンパク質が尿中に排泄されることを示した。また、尿中で分解不全なミトコンドリアタンパク質が検出されたことから、マイトファジーに関わるリソソームの損傷（不全）とリソソームを選択的に隔離、修復するリソファジーの誘導が予測された。ミトコンドリアとリソソームの機能低下は、糖尿病性腎症発症・進展の一端を担っており、これらの機能評価は、腎機能評価に繋がると考える。
目的は、糖尿病性腎症の早期診断マーカーとして糖尿病で損傷したミトコンドリアとリソソームの品質管理システム（マイトファジー、リソファジー）と尿中への分解・排泄メカニズムを明らかにし、糖尿病性腎症の早期診断法を確立することである。本年度の研究概要は以下である。
１．動物実験 尿中ミトコンドリアタンパク質の排泄に関わるマイトファジー解析の一環として、マイトファジー亢進と共に1)ミトコンドリアでのエネルギー生成を担う脂肪酸代謝は、ω6脂肪酸からω3脂肪酸（抗酸化・血管保護作用）への脂肪酸代謝シフトが示された。2) 脂肪酸のミトコンドリア内膜透過を担うアシルカルニチンは高値を示した。3) リソソームの品質管理システムであるリソファジーとリソソーム修復は、亢進傾向を示した。
２．臨床研究 研究対象者を「慢性腎臓病(CKD)診療ガイドライン2018(日本腎臓学会)」により分類した4群の患者尿検体採取・分析を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年度に想定した研究目的の進捗状況は、「動物実験」ではおおむね順調に進展しているものの「臨床研究」ではやや遅れている。
１．動物実験
腎症発症前糖尿病（2週間）ラットの腎皮質において、①ミトコンドリアの品質管理システムであるマイトファジーの関連タンパク質(PINK1、LC3-II)の発現は亢進を示し③リソソームの品質管理システムであるリソファジーの関連タンパク質(FBXO27, LAMP2)とリソソーム修復タンパク質(Gal3)の発現は、亢進傾向を示した。これらは腎臓の免疫組織化学染色において近位尿細管部位に優位に発現していた。腎症発症前糖尿病ラットの腎皮質において、マイトファジー、リソソーム修復およびリソファジーが誘導されたことを確認した。これらの現象は、TLMの抗酸化効果により抑制されたため、酸化ストレス障害によって引き起こされる腎皮質のミトコンドリアとリソソームの品質管理メカニズムである可能性が示唆された。
２．臨床研究
患者尿検体採取・分析を進めている。また、研究対象者を「慢性腎臓病(CKD)診療ガイドライン2018(日本腎臓学会)」により分類した4群の患者尿検体の十分な採取のため、現協力病院に加え、新たな協力病院として共同研究を開始した。2024年6月までに当大学の「研究倫理審査委員会」へ「協力病院の追加申請」を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度は、「動物実験」と「臨床研究」を並行し検討を行う予定である。
１．動物実験
１）マイトファジー分解不全尿中ミトコンドリアタンパク質の排泄パターン解析 同定された4種のミトコンドリアタンパク質（ATP5S, AK2, Cpox、TUFM）のウエスタンロッティング画像パターン解析を①腎症発症前の糖尿病（2週間）ラットと②糖尿病性腎症（糖尿病4週間）ラットにおいて引き続き行う。 ２）マイトファジーに関わるリソゾームの機能解析 腎症発症前の糖尿病（2週間）ラット腎皮質において、リソソームを①選択的に分解除去するリソファジーの関連タンパク質（FBXO27、LAMP2）と②リソソーム修復タンパク質(Gal3, ESCRT)、③リソソーム生合成タンパク質(TFEB)のウエスタンロッティング分析と腎組織免疫化学染色を行う。 ３）尿中リソソームタンパク質の解析 腎症発症前の糖尿病（2週間）ラットにおいてリソソームタンパク質のプロテオーム解析を行う。 ３）電子顕微鏡解析と腎症発症前糖尿病ラットの腎初代培養によるミトコンドリアとリソソームの機能確認を行う。
２．臨床研究
研究対象者を「慢性腎臓病(CKD)診療ガイドライン2018(日本腎臓学会)」により分類した4群の患者尿検体の十分な採取を現協力病院と新規協力病院において行い、尿中ミトコンドリアタンパク質排泄解析（プロテオーム解析）を進める。
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