| Project/Area Number |
21K07568
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52040:Radiological sciences-related
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
笹尾 明 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 特任講師 (30508487)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺沢 宏明 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (10300956)
笹尾 亜子 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (80284751)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 炭素13 / 抗体 / 13C-MRI / MRI / アミノ酸 |
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| Outline of Research at the Start |
13C標識物質の使用に際して放射線被曝がなく施設の臨床用MRI装置の利用も期待できるなどの長所を併せ持つ。しかし、13CのMRIはプロトンと比較して信号比は0.16程度と感度の低さが欠点である。これに対して我々は、13Cで標識されたアミノ酸を複数回投与する事で病変部へ13Cを集積させ、それによって13Cの画像化が明瞭に描出できることを明らかにした。本研究では、これまでの方法を発展させ、さらに抗体の集積性に着目して13C標識抗体をトレーサーとした薬剤や腫瘍などの分子イメージングを簡便かつ低侵襲に行うことができる方法論を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗体への13C導入として、13C標識アミノ酸を抗体産生細胞であるハイブリドーマ細胞の培養液に添加する方法を行ったが、導入困難であったため、既存の抗体やタンパク質、薬剤などに後から13Cを高効率に導入する方法を試行した。まずは、入手しやすいウシ血清アルブミンにEDC/Water soluble carbodiimide + Sulfo NHSを使用してメチル13Cメチオニンのカルボキシル基をタンパク質側のリジンのεアミノ基と架橋させることとした。未反応の試薬は過剰量のグリシン溶液でクエンチし、10ｋDaのスピンカラムを用いて限外ろ過により除去した。未反応のメチル13Cメチオニンが十分除去された反応物の13C- NMR測定したところ、積算時間3分程度で標識したメチル13Cの鋭いがみられた。この結果は「第51回日本磁気共鳴医学会大会（軽井沢）」にて発表を行っている。さらに、一度反応させたサンプルに対して前述のメチル13Cメチオニン架橋を多段階で行うと架橋効率が上昇し、信号強度が上昇する現象がみられたが、タンパク質への過度の架橋は立体構造の変化を起こし、抗体やタンパク質の本来の機能を損なう可能性があるため、反応回数には制限があると考えられた。そこで、中心にジスルフィド結合を有し、還元後にアミノ基-スルフヒドリル基間架橋剤にてタンパク質に結合可能なCystamine core dendrimerを使用することを考えた。市販されているPAMAM dendrimer, cystamine core, generation 2.0 solutionは樹状部末端に計16個のアミノ基を有しており、この部分にメチル13Cメチオニンのカルボキシル基を架橋した。反応物を3kDaのフィルターで精製して、13C-NMRにて信号確認したところ約30秒で良好な信号を得ることができるようになってきている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質や抗体に13Cを導入する技術に関して直接タンパク質構造内に組み込むことは困難であったが、アミノ基とカルボキシル基の穏やかな条件での架橋反応が汎用的に使用可能となったため、研究の進捗が速くなった。現在、13C-NMRの信号をさらに上昇させる反応方法を開発中であり、順調に進展しているものと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
デンドリマーへの13Cメチオニン架橋反応は安定して行うことができるが、反応にあずからないメチオニンのアミノ基は遊離した状態である。このアミノ基に対してメチオニンが連鎖的に結合しすぎると分子量が増大しすぎてしまい13C-NMR信号のブロード化の恐れがあるため、酢酸やプロピオン酸などのカルボン酸で遊離アミノ基にキャップを行う方向で反応を調整する。また、これらのカルボン酸に13C標識したものを用いて、さらに13C-NMR信号の増強を図る。出来上がった化合物を抗体に架橋し、ELISA等のin vitro実験で画像化確認を行い、組織や生体での画像化を試みる。
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