| Project/Area Number |
21K07753
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
小林 弘典 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 講師 (70397868)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | VLCAD / MCAD / 酵素活性測定 / LC-MS/MS / 新生児マススクリーニング / 極長鎖アシルCoA脱水素酵素 / 残存酵素活性測定 / 極長鎖アシルCoA脱水素酵素欠損症 / 中鎖アシルCoA脱水素酵素欠損症 / タンデムマス / 脂肪酸代謝異常症 / 酵素活性 |
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| Outline of Research at the Start |
タンデムマスによる新生児マススクリーニング（NBS)が実施されるようにり，脂肪酸代謝異常症においては従来は発見されていない遺伝子型を有する患児が発見されるようになった．これらの患児は，NBS前診断例とは異なる遺伝子型を有する例も多い．またその中には極めて軽症もしくは無症候であると推測されるような例もいる．適切な治療や予後予測を行ううえでもこの様な新規変異を有する例の酵素活性値を簡便に評価する仕組みが求められている．本研究ではMCAD欠損症およびVLCAD欠損症について，培養皮膚線維芽細胞に新規遺伝子を組み込み，酵素活性を測定することで病原性の評価を行う．
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| Outline of Annual Research Achievements |
HEK293細胞における内在性VLCADとMCADをCrisperCas9の技術を用いて、ノックアウトした。ノックアウトの確認はWestern blotとRealtime PCRを用いて確認した。本年度はこのVLCAD-/MCAD-株を用いて，Wild type，ACADVL遺伝子のp.C607Sを含む新規バリアントなどを組み込んだプラスミドのトランスフェクションを行い，酵素学的な検討を行う予定であったが，VLCAD-/MCAD-株における酵素活性が十分に低下していない事が明らかになった．原因を検索したところ，ヒト細胞では通常ほとんど発現していないLCADが代償的に発現上昇し，結果として酵素活性が補完されている事が明らかになった．よって，LCADについてもノックアウトを行うべく研究計画を修正した．
LC-MS/MSによる酵素活性測定については，HEK293細胞をhomogenateし、その上澄みと基質であるC16-CoAを反応させた。0分、2.5分、5.0分、7.5分、10.0分の5点で生成物であるC16:1-CoAの濃度を測定した。その結果、2.5分値が本アッセイにおける指摘時間と結論した．
酵素反応の過程でリン酸含有バッファーを用いるため、LC-MS/MSの感度が低下するなどの問題点が挙がり、測定は可能だが再現性に乏しい問題が生じた。その後LC-MS/MSの測定条件変更を重ねた結果、分析における課題は解決した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
既報を参考にHEK293細胞におけるVLCAD-/MCAD-株を作成したが，通常ヒト細胞ではほとんど発現していないLCADが代償的に発現上昇し，結果として酵素活性が補完されている事が明らかになった．よって，LCADについてもノックアウトを行うべく研究計画を修正したため．
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| Strategy for Future Research Activity |
LCADについてもCRISPER/Cas9でノックアウトを試みる事とし，再度計画を変更した．すでに変更した研究には取りかかっているところである．
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