The development of in vitro functional assay system for the genetic variants in inherited autoinflammatory diseases.

• Project/Area Number: 21K07770
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 大西 秀典 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60381620)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 自己炎症性疾患 / 遺伝子変異 / 原発性免疫不全症 / 遺伝子解析 / 病的意義不明バリアント

Outline of Research at the Start

近年、遺伝性自己炎症疾患を含む原発性免疫不全症(PID)について、次々に新たな責任遺伝子が明らかとなっている。多くの症例で遺伝子解析が行われるようになったが、解析事例の中には病原性不明のバリアント(VUS) が同定され、遺伝子解析だけでは問題解決に至らない症例が多数発生しており問題視されている。 本研究では自験例や、国内で発生し自己炎症疾患が疑われた症例の情報を日本免疫不全・自己炎症学会と連携し集積し、遺伝子解析の結果同定されたVUSについて評価するin vitro実験系を構造生物学的な技術を駆使して構築を試みる。これにより患者の確定診断、適切な治療につなげ医療に貢献することを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は最近発見された遺伝性自己炎症性疾患の責任遺伝子のうち以下の3つのカテゴリーの疾患群について、病的意義不明バリアント(VUS)の評価実験系を構築することである。
①自己炎症性角化症の解析: IL36RN遺伝子変異の評価系構築及びIL-36Ra-IL-36受容体複合体構造解析。培養細胞レベルの機能実験系は確立済みである。構造解析に向けたタンパク試料の調整を行なっている。②若年発症ベーチェット病の解析: TNFAIP3遺伝子変異の評価系構築。培養細胞レベルの機能実験系は確立済みである。2022年度は全国調査で新規に見出されたスプライス部位変異について、mini gene splicing assayの実験系を構築し、解析した。③新規I型インターフェロン症の解析: PSMB9異常症、SAMD9L関連自己炎症性疾患、IKBKG関連自己炎症性疾患のそれぞれの症例で同定された遺伝子変異の評価系構築。IKBKGについては培養細胞レベルの機能実験系は確立済みであり、特にPSMB9 , SAMD9Lについては疾患特異的モデル細胞、動物実験系の確立を目指している。2022年度はSAMD9LについてVUS判定を目的とした患者由来細胞及び遺伝子変異形質転換細胞で細胞増殖能を評価する実験系の構築を目指した検討を行った。不死化B細胞を用いたBrdU法による細胞増殖能実験で有意な結果が得られた。
これら3つのカテゴリーの疾患の解析を対象となる患者情報の集積、培養細胞実験、リコンビナントタンパク精製、立体構造解析を引き続き行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究は概ね予定通り進捗している。

Strategy for Future Research Activity

本研究では、遺伝性自己炎症疾患の責任遺伝子のうち、IL36RN、TNFAIP3、PSMB9、SAMD9L、IKBKG の5遺伝子を対象とした解析を行う。状況に応じて、解析遺伝子を追加する可能性がある。
令和5年度の計画)
1. 申請者が分担研究者として参画しているAMED難治性疾患実用化研究事業「従来のゲノム解析 で診断困難な原発性免疫不全症患者の診断法の開発」班と連携し、原因不明自己炎症性疾患疑い症例の網羅的遺伝子解析を行う。2. 前年度までに作成した遺伝子欠失培養細胞株に、レンチウイルス等を用いてPSMB9、SAMD9L、TNFAIP3及びIKBKG遺伝子のそれぞれ野生型及び変異型を導入し安定発現株を作成する。3. 2.で作成した疾患モデル細胞の機能評価をNF-κB転写活性、IFN-α等サイトカイン産生能、細胞増殖能などを評価することで比較検討する。特にTNFAIP3遺伝子については複数のVUS情報の蓄積があるためその全ての解析を行いデータベース化を目指す。4. IL-36Ra、IL-36R複合体タンパクの構造解析を行う。5. 4.で得られた構造情報を元にタンパク間相互作用が推定されるアミノ酸残基に変異を導入した変 異体タンパクを精製する。6. 5.で作成した変異体タンパクについて、タンパク-タンパク間相互作用解析(NMR, BiaCORE等)や、 HEK293細胞を使用した細胞培養実験でIL-36シグナル伝達実験系の活性を検証する等で構造、 機能の評価を行う。上述の検討により遺伝性AIDの責任遺伝子のうち、IL36RN、TNFAIP3、PSMB9、SAMD9L、IKBKG の5遺伝子のVUSを判定するin vitro実験系を確立し、実際に日本免疫不全自己炎症学会に問い合わせのあったVUSの評価を随時行うことで、医療に貢献する。

Research Products

• [Journal Article] A complementary approach for genetic diagnosis of inborn errors of immunity using proteogenomic analysis (2023)
  • Author(s): Sakura F, Noma K, Asano T, Tanita K, Toyofuku E, Kato K, Tsumura M, Nihira H, Izawa K, Mitsui-Sekinaka K, Konno R, Kawashima Y, Mizoguchi Y, Karakawa S, Hayakawa S, Kawaguchi H, Imai K, Nonoyama S, Yasumi T, Ohnishi H, Kanegane H, Ohara O, Okada S
  • Journal Title: PNAS Nexus Volume: 2 Issue: 4 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1093/pnasnexus/pgad104
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development of a system adapted for the diagnosis and evaluation of peroxisomal disorders by measuring bile acid intermediates (2023)
  • Author(s): Kawai Hiroki、Takashima Shigeo、Ohba Akiko、Toyoshi Kayoko、Kubota Kazuo、Ohnishi Hidenori、Shimozawa Nobuyuki
  • Journal Title: Brain and Development Volume: 45 Issue: 1 Pages: 58-69
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2022.10.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A case of VEXAS syndrome (vacuoles, E1 enzyme, X-linked, autoinflammatory, somatic) with decreased oxidative stress levels after oral prednisone and tocilizumab treatment (2022)
  • Author(s): Tozaki Nagie、Tawada Chisato、Niwa Hirofumi、Mizutani Yoko、Shu En、Kawase Aki、Miwa Yuki、Ohnishi Hidenori、Sasai Hideo、Miyako Keisuke、Hosokawa Junichi、Kato Ayaka、Kobayashi Kazuhiro、Miyazaki Tatsuhiko、Shirakami Yohei、Shimizu Masahito、Iwata Hiroaki
  • Journal Title: Frontiers in Medicine Volume: 9 Pages: 1046820-1046820
  • DOI: 10.3389/fmed.2022.1046820
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Clinical and Genetic Characterization of Patients with Artemis Deficiency in Japan (2022)
  • Author(s): Inoue Kento、Miyamoto Satoshi、Tomomasa Dan、Adachi Eriko、Azumi Shohei、Horikoshi Yasuo、Ishihara Takashi、Osone Shinya、Kawahara Yuta、Kudo Ko、Kato Zenichiro、Ohnishi Hidenori、Kashimada Kenichi、Imai Kohsuke、Ohara Osamu、van Zelm Menno C.、Cowan Morton J.、Morio Tomohiro、Kanegane Hirokazu
  • Journal Title: Journal of Clinical Immunology Volume: 43 Issue: 3 Pages: 585-594
  • DOI: 10.1007/s10875-022-01405-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Novel STAT1 Variants in Japanese Patients with Isolated Mendelian Susceptibility to Mycobacterial Diseases (2022)
  • Author(s): Ono R, Tsumura M, Shima S, Matsuda Y, Gotoh K, Miyata Y, Yoto Y, Tomomasa D, Utsumi T, Ohnishi H, Kato Z, Ishiwada N, Ishikawa A, Wada T, Uhara H, Nishikomori R, Hasegawa D, Okada S, Kanegane H.
  • Journal Title: Journal of Clinical Immunology Volume: 43 Issue: 2 Pages: 466-478
  • DOI: 10.1007/s10875-022-01396-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Assessment of type I interferon signatures in undifferentiated inflammatory diseases: A Japanese multicenter experience. (2022)
  • Author(s): Miyamoto T, Honda Y, Izawa K, Kanazawa N, Saito MK, Takita J, Nishikomori R, Yasumi T, et al.
  • Journal Title: Front Immunol Volume: 13 Pages: 905960-905960
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.905960
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comprehensive targeted next-generation sequencing in patients with slow-flow vascular malformations (2022)
  • Author(s): Nozawa Akifumi、Fujino Akihiro、Yuzuriha Shunsuke、Suenobu Souichi、Kato Aiko、Shimizu Fumiaki、Aramaki-Hattori Noriko、Kuniyeda Kanako、Sakaguchi Kazuya、Ohnishi Hidenori、Aoki Yoko、Ozeki Michio
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 67 Issue: 12 Pages: 721-728
  • DOI: 10.1038/s10038-022-01081-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Serum Fibrinogen Level and Cytokine Production as Prognostic Biomarkers for Idiopathic Sudden Sensorineural Hearing Loss (2022)
  • Author(s): Okuda Hiroshi、Aoki Mitsuhiro、Ohashi Toshimitsu、Ogawa Bakushi、Shibata Hirofumi、Ueda Natsuko、Hayashi Hisamitsu、Nishihori Takezumi、Kuze Bunya、Ohnishi Hidenori、Ogawa Takenori
  • Journal Title: Otology & Neurotology Volume: 43 Issue: 7 Pages: 712-719
  • DOI: 10.1097/mao.0000000000003552
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neutralizing Type I Interferon Autoantibodies in Japanese Patients with Severe COVID-19 (2022)
  • Author(s): Eto S, Nukui Y, Tsumura M, Nakagama Y, Kashimada K, Mizoguchi Y, Utsumi T, Taniguchi M, Sakura F, Noma K, Yoshida Y, Ohshimo S, Nagashima S, Okamoto K, Endo A, Imai K, Kanegane H, Ohnishi H, Hirata S, Sugiyama E, Shime N, Ito M, Ohge H, Kido Y, Bastard P, Casanova JL, Ohara O, Tanaka J, Morio T, Okada S
  • Journal Title: Journal of Clinical Immunology Volume: 42 Issue: 7 Pages: 1360-1370
  • DOI: 10.1007/s10875-022-01308-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] An adult case of suspected A20 haploinsufficiency mimicking polyarteritis nodosa (2022)
  • Author(s): Niwano Tomoko、Hosoya Tadashi、Kadowaki Saori、Toyofuku Etsushi、Naruto Takuya、Shimizu Masaki、Ohnishi Hidenori、Koike Ryuji、Morio Tomohiro、Imai Kohsuke、Yoshida Masayuki、Yasuda Shinsuke
  • Journal Title: Rheumatology Volume: 61 Issue: 11 Pages: e337-e340
  • DOI: 10.1093/rheumatology/keac308
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Monogenic causes of pigmentary mosaicism (2022)
  • Author(s): Saida Ken、Chong Pin Fee、Yamaguchi Asuka、...Mitsuhiro Kato, et al.
  • Journal Title: Human Genetics Volume: 141 Issue: 11 Pages: 1771-1784
  • DOI: 10.1007/s00439-022-02437-w
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dysregulation of the Intestinal Microbiome in Patients With Haploinsufficiency of A20 (2022)
  • Author(s): Toyofuku Etsushi、Takeshita Kozue、Ohnishi Hidenori、Kiridoshi Yuko、Masuoka Hiroaki、Kadowaki Tomonori、Nishikomori Ryuta、Nishimura Kenichi、Kobayashi Chie、Ebato Takasuke、Shigemura Tomonari、Inoue Yuzaburo、Suda Wataru、Hattori Masahira、Morio Tomohiro、Honda Kenya、Kanegane Hirokazu
  • Journal Title: Frontiers in Cellular and Infection Microbiology Volume: 11 Pages: 787667-787667
  • DOI: 10.3389/fcimb.2021.787667
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Case Report: Analysis of Preserved Umbilical Cord Clarified X-Linked Anhidrotic Ectodermal Dysplasia With Immunodeficiency in Deceased, Undiagnosed Uncles (2021)
  • Author(s): Inaba Satoshi、Aizawa Yuta、Miwa Yuki、Imai Chihaya、Ohnishi Hidenori、Kanegane Hirokazu、Saitoh Akihiko
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: 12 Pages: 786164-786164
  • DOI: 10.3389/fimmu.2021.786164
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A20 Haploinsufficiency in East Asia (2021)
  • Author(s): Kadowaki Tomonori、Kadowaki Saori、Ohnishi Hidenori
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: 12 Pages: 780689-780689
  • DOI: 10.3389/fimmu.2021.780689
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Heterozygous missense variant of the proteasome subunit β-type 9 causes neonatal-onset autoinflammation and immunodeficiency (2021)
  • Author(s): Kanazawa N, Hemmi H, Kinjo N, Ohnishi H, Hamazaki J, M.H, K.A, M.T, H.S, K.N, K.S, H.Y, I.K, N.R, T.M, Y.Y, T.S, O.T, O.T, K.T, S.I, F.Y, W.N, I.Y, K.K, O.S, T.T, N.K, M.S, Y.K, Kaisho T
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 0-0
  • DOI: 10.1038/s41467-021-27085-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] An infant with X-linked anhidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency presenting with Pneumocystis pneumonia: A case report. (2021)
  • Author(s): Toyohara M, Kajiho Y, Toyofuku E, Takahashi C, Owada K, Kanda S, Harita Y, Ohnishi H, Wada T, Imai K, Kanegane H, Morio T, Oka A
  • Journal Title: Clin Case Rep Volume: 9 Issue: 11
  • DOI: 10.1002/ccr3.5093
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hematopoietic Cell Transplantation Ameliorates Autoinflammation in A20 Haploinsufficiency (2021)
  • Author(s): Shiraki, M. Williams, E. Yokoyama, N. Shinoda, K. Nademi, Z. Matsumoto, K. Nihira, H. Honda, Y. Izawa, K. Nishikomori, R. Slatter, M. A. Cant, A. J. Gennery, A. R. Ohnishi, H. Kanegane, H.
  • Journal Title: J Clin Immunol Volume: 41 Issue: 8 Pages: 1954-1956
  • DOI: 10.1007/s10875-021-01124-1
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Successful treatment of a novel type I interferonopathy due to a de novo PSMB9 gene mutation with a Janus kinase inhibitor (2021)
  • Author(s): Kataoka S, Kawashima N, Okuno Y, Muramatsu H, Miwata S, Narita K, Hamada M, Murakami N, Taniguchi R, Ichikawa D, Kitazawa H, Suzuki K, Nishikawa E, Narita A, Nishio N, Yamamoto H, Fukasawa Y, Kato T, Yamamoto H, Natsume J, Kojima S, Nishio I, Taketani T, Ohnishi H, Tahakashi Y.
  • Journal Title: Journal of Allergy and Clinical Immunology Volume: - Issue: 2 Pages: 639-644
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2021.03.010
  • NAID: 120007192018
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 自己炎症性症候群の現状の把握、未来に向けてのメッセージ 自己炎症性症候群の新規疾患. (2022)
  • Author(s): 大西 秀典
  • Organizer: 日本小児リウマチ学会総会・学術集会(第31回)
• [Presentation] 自己炎症性疾患 PFAPAその鑑別疾患（HA20、高IgD症候群など）. (2022)
  • Author(s): 大西 秀典
  • Organizer: 日本小児感染症学会学術集会(第54回)
• [Presentation] 免疫不全症を伴う遺伝性自己炎症性疾患 (2022)
  • Author(s): 大西秀典
  • Organizer: 日本免疫不全・自己炎症学会総会(第5回)
• [Presentation] 先天性免疫異常症におけるJAK阻害剤の適応と最近の話題 (2021)
  • Author(s): 大西秀典
  • Organizer: 日本小児リウマチ学会総会・学術集会(第30回)
• [Presentation] Monogenic VasculitisとしてのA20ハプロ不全症 (2021)
  • Author(s): 大西秀典
  • Organizer: 日本小児リウマチ学会総会・学術集会(第30回)