Neuron-specific persistent cytomegalovirus infection in the developing cerebrum
| Project/Area Number |
21K07816
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
|
|---|
| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
小杉 伊三夫 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (10252173)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
|
|---|
| Keywords | サイトメガロウイルス / 脳発達障害 / 周産期 / 神経細胞特異的エンハンサー / e1-プロモーター / 持続感染 / 大脳神経細胞 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
CMVは胎内感染で脳障害を生ずる原因ウイルスとして最重要である。これまでのマウスCMV(MCMV)を用いた感染モデルによって、生後第2週(ヒト周産期初期に相当)から1ヶ月までの大脳では皮質・海馬の神経細胞にのみ持続感染することが判っている。さらに，非神経細胞と異なり神経細胞におけるMCMV-e1遺伝子プロモーター (e1-pro)の活性化には、e1-pro上流のエンハンサー(neuron-specific enhancer)が関与することを明らかにした。本研究では、同エンハンサーにおいて神経細胞特異的なe1-pro活性化に関わる領域を特定し、転写因子等の宿主側・ウイルス側因子の同定を試みる。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
21年度までの実績：MCMV-e1-proにおいて転写開始点からnt -172までがMCMV-IE3結合によるe1-pro活性化に必須とされている．しかし，nt -1000までにIE3結合モチーフが35個存在していることから，これらの結合モチーフがIE3結合によるe1-pro活性化にどの程度関与するかについて検討を行った．転写開始点から，nt -943, nt -839, nt -556, nt -449, nt -193までのe1-pro領域を欠損したe1-proレポータープラスミド，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP, p-e1proΔ556-EGFP, p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPを作成した．
22年度実績：上記のプラスミドをpcDNA-MCMV-ie3と共にHEK293T細胞に導入し，EGFP発現を比較した．その結果，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP導入細胞では，EGFP発現は極僅かであった．しかし，p-e1proΔ556-EGFP導入細胞で急激な発現増を認め，p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPでは暫時発現が増強していった．従って，nt -839までの上流域に存在するIE3結合モチーフもe1-pro活性化に関与し得ることが明らかとなった．このことからnt -449からnt -1373に存在する神経細胞特異的エンハンサーの作用にIE3の結合が関わると推測された．また，核移行シグナルの付いたAcGFP1を組み込んだMCMV作製を試みた．具体的にはpLtRt(NheI-)-e1pro1.4-EGFPをNheI/EcoRV Diggestionして，PCR増幅したAcGFP1-NucをNheI/EcoRV siteに組み込んで，pLtRt(NheI-)-e1pro1.4-AcGFP1-Nucを作製した．このトランスファープラスミドから相同組み換え用カセットを切り出し，相同組み換えによって，rMCMV-1373-nucとrMCMV-448-nucを作製することができた．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MCMV-e1プロモーター領域に変異を導入した遺伝子組替えMCMVの作成に時間を要している.
|
| Strategy for Future Research Activity |
1.MCMV e1-enhancerにおける神経細胞特異的なe1-pro活性化に関わる領域の特定
1e1-enhancer領域(925nt: 161605-162529: gene accession number U68299)を長さ400~500ntの左右2区域に分割し、PCR法によって増幅する。 各々のDNA配列 を、e1-pro-448を含む基本トランスファープラスミド(pMCMV-e1-pro448)のプロモーター直上に組込んで、組換え用トランスファープラスミド(pMCMV-e1- enhancer-Lt or -Rt/pro448)を作製する。
2上記pMCMV-e1-enhancer-Lt or -Rt/pro448から相同組換え用DNA配列を切 り出しMCMV野生株(Smith株)が感染したマウスNIH3T3細胞に導入し、相同組換え法に よって2種類の組換えMCMV(rMCMV)を作製する。 3上記rMCMVを初代培養マウス大脳神経細胞及びマウス新生仔大脳に感染させ、rMCMV1373・rMCMV448感染細胞と比較し前者と同様にEGFPを発現するe1-short enhancer領域を確定する。
4確定されたe1-short enhancer領域を2分割し、上記1)-3)と同様の方法で神経細胞特異的に活性化する領域を 絞り込む。5CRSPR-CAS9による遺伝子編集技術を用 いて上記で同定された神経細胞特異的に活性化する領域を欠失したrMCMVを作製する。初代 培養神経細胞及び新生仔大脳における同ウイルスの感染性について検 討する。
|
Report
(2 results)
Research Products
(18 results)
-
-
-
[Journal Article] Behçet's Disease with Bilateral Renal Infarction Due to Mucormycosis2022
Author(s)
Shimoyama K, Niwa T, Furukawa S, Morishita N, Nagakura Y, Yonezawa H, Hatakeyama M, Okubo Y, Suzuki D, Kosugi I, Shiogama K, Ogawa N
-
Journal Title
Internal Medicine
Volume: 61
Issue: 7
Pages: 1077-1083
DOI
NAID
ISSN
0918-2918, 1349-7235
Year and Date
2022-04-01
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
-
-
[Journal Article] The potential of a universal influenza virus-like particle vaccine expressing a chimeric cytokine2022
Author(s)
Nerome K, Imagawa T, Sugita S, Arasaki Y, Maegawa K, Kawasaki K, Tanaka T, Watanabe S, Nishimura H, Suzuki T, Kuroda K, Kosugi I, Kajiura Z
-
Journal Title
Life Sci Alliance
Volume: 6
Issue: 1
Pages: e202201548-e202201548
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
-
-
[Journal Article] Prevalence of UL97 gene mutations and polymorphisms in cytomegalovirus infection in the colon associated with or without ulcerative colitis2021
Author(s)
Satoshi Tamura, Satoshi Osawa, Natsuki Ishida, Takahiro Miyazu, Shinya Tani, Mihoko Yamade, Moriya Iwaizumi, Yasushi Hamaya, Isao Kosugi, Takahisa Furuta, Ken Sugimoto
-
Journal Title
Scientific Reports
Volume: 11
Issue: 1
Pages: 13676-13676
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
-
-
-
[Journal Article] Metformin reduces pleural fibroelastosis by inhibition of extracellular matrix production induced by CD90-positive myofibroblasts2021
Author(s)
Aoshima Y, Enomoto Y, Fukada A, Kurita Y, Matsushima S, Meguro S, Kosugi I, Kawasaki H, Katsura H, Fujisawa T, Enomoto N, Nakamura Y, Inui N, Suda T, Iwashita T
-
Journal Title
Am J Transl Res
Volume: 13
Pages: 12318-12337
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
-
-
-
-
-
-
-
