| Project/Area Number |
21K07931
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
諸井 林太郎 東北大学, 大学病院, 助教 (90803594)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒羽 正剛 東北大学, 医学系研究科, 大学院非常勤講師 (70709469)
角田 洋一 東北大学, 大学病院, 助教 (50509205)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | オルガノイド / RAP1A / 単層培養 / タイトジャンクション / クローン病 |
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| Outline of Research at the Start |
膨大な量の腸内細菌と直接接触する腸粘膜上皮は、上皮間のタイトジャンクションによる防御機構が存在する。これらの異常による粘膜防御の破綻が免疫過剰応答を惹起し、クローン病の発症に関連することが推定されている。2019年、当科から日本人CDの新規疾患感受性遺伝子RAP1Aを報告した。CDの病態への関与は不明であったが、2020年にRAP1Aの上皮タイトジャンクションとの関与が報告された。本研究では、近年確立されつつあるオルガノイドを２次元単層培養する手法を用いて、クローン病由来上皮の粘膜透過性・タイトジャンクションの検証を目的とした。
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| Outline of Annual Research Achievements |
約３０症例でクローン病患者由来のオルガノイドの樹立に成功した。単層培養を用いた抵抗値の検証には、安定的、かつ再現性のある実験系の構築が望まれるため、まずは条件設定を行った。Millicell電気抵抗値測定システムを用いて単層培養のTEERを測定したところ、経時的にTEERは上昇し、樹立３日後はTEER:200Ωcm2程度だったものが、５日目では400Ω
cm2、10日後は1000Ωcm2、17日目で1400Ωcm2程度のピークとなり、以降細胞の死滅とともにTEERの低下を確認できた。樹立後10日が最も検証に適した状態と判断した。その後、様々な因子によりTEERが変動するかどうかを検証した。まずは、腸内細菌をターゲットとし、LPS(1ng/ml)の負荷を試みた。LPS負荷とコントロールには電気抵抗値に差を認めず、LPSはクローン病上皮の粘膜電気抵抗値に関与しないことを明らかとした。次に、TNFα、およびインターフェロンの負荷を行った。24時間負荷することで、抵抗値はコントロールと比較して約40%まで低下することが明らかとなり、IBD関連の炎症性サイトカインが、腸管上皮細胞の粘膜電気抵抗の低下を惹起することがあきらかとされた。次に、RAP1A遺伝子多型のタイトジャンクションの機能解析を施行した。大腸、小腸オルガノイドどちらにおいても、RAP1Aリスクアレル別(AA,TA.TT)ではタイトジャンクションの抵抗値に差は認めなかった。RAP1A阻害剤であるGGTI298を用いてRAP1Aの機能を抑制したが、それぞれで有意差は認めなかった。上皮オルガノイドにおけるタイトジャンクションはTNFαによる炎症性サイトカインによる影響が大きと推定された。
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