Elucidation of irreversible switch mechanism in hepatic stellate cell activation

• Project/Area Number: 21K07968
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53010:Gastroenterology-related
• Research Institution: Osaka Metropolitan University (2022); Osaka City University (2021)
• Principal Investigator: 松原 三佐子 (佐藤三佐子) 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 准教授 (00635120)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松原 勤 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20628698)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 肝星細胞 / 肝細胞 / 線維化 / 肝発がん / サイトグロビン / 細胞間相互作用 / ミトコンドリア呼吸鎖 / DNA損傷

Outline of Research at the Start

肝硬変は、慢性的炎症による持続的な肝星細胞 (HSC) の活性化を主因し、結合組織
沈着を伴った肝機能障害を特徴とする。肝線維化は、HSC活性化が可逆的にも関わらず、病因が排除されても病態が進行する事が問題となっている。本研究では、HSC活性化が持続的かつ不可逆的になるHSC活性化スイッチ機構が存在し、それが肝硬変の難治性に繋がっていると考え、①HSCの不可逆的な活性化に関わるDNA損傷部位の同定、②不可逆的な活性化におけるDNA修復酵素PARP1の意義などHSC活性化スイッチ機構の解明、③肝機能における活性化HSCの影響を検証しながら、肝硬変の分子病態を理解するために本申請課題を提案する。

Outline of Annual Research Achievements

肝がん誘発モデルにおいてサイトグロビン（Cytoglobin、CYGB） 欠損マウスでは野生型に比べ易発がん性である。私はこれまで、肝星細胞（Hepatic Stellate cells,HSC）におけるCYGBの発現調節機構を詳細に解析すると同時に、HSC活性化が持続的かつ不可逆的になるHSC活性化スイッチ機構が存在し、それが肝硬変の難治性および肝発がんに繋がっていると考えて研究を行ってきた。2022年度、CYGB欠損マウスを用いてHSCが隣接する肝細胞に与える影響を調べた。その結果、CYGB 欠損HSCは、野生型HSCに比べ、膜透過性ガス代謝物である一酸化窒素を過剰産生することがわかった。さらに、CYGB KOの肝細胞では、ミトコンドリア呼吸鎖‐電子伝達系に関わるシトクロムＣオキシダーゼが可逆的に阻害されていることが示された。CYGB KO肝細胞のミトコンドリアから精製されたシトクロムＣオキシダーゼ画分には一酸化窒素が大量に含まれており、これにより一酸化窒素がシトクロムＣオキシダーゼに結合することが示された。また、オキシヘモグロビンの添加により、一酸化窒素結合によるシトクロムCオキシダーゼ活性の阻害が消失することが判明した。したがって、本研究では、CYGB欠損マウスにおけるミトコンドリア呼吸鎖‐電子伝達系における呼吸機能の慢性的な減弱が、過剰な活性酵素種の形成を促し、肝障害を引き起こすことを示した。この研究の結果は、HSCのCYGB欠乏が隣接する肝細胞に直接影響を及ぼし、肝細胞障害を誘発することを示し、国際雑誌Antioxid. Redox Signal.で報告した（Antioxid. Redox Signal. 38, 463-479.2022）。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初の目的通り（a）Cygb欠損マウスの肝臓よりミトコンドリアを採取・精製し、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素活性を測定した。さらに、(b)肝細胞とHSCの共培養実験を行い、HSC-Cygb欠損による肝細胞への影響を調べた (c)DNA損傷関連因子であるPARP１に着目し、TGF-β処理後H2O2に暴露されたHSC細胞（CYGB低発現）のDNAを採取し、ChIP- Sequecing用のDNAのSonicationおよびLibrary作製を行った。（a,b）に関しては論文および国内外の国際学会で報告し当初の計画以上に進展している。

Strategy for Future Research Activity

今年度は、DNA損傷関連因子であるPARP１に着目し、TGF-β処理後H2O2に暴露されたHSC細胞（CYGB低発現）のDNAを採取したChIP- Sequecingの結果を基に統計学的解析を行う予定である。

Research Products

• [Journal Article] Nitric Oxide Derived from Cytoglobin-Deficient Hepatic Stellate Cells Causes Suppression of Cytochrome c Oxidase Activity in Hepatocytes (2023)
  • Author(s): Yoshinori Okina, Misako Sato-Matsubara, Yasutoshi Kido, Hayato Urushima, Atsuko Daikoku, Chiho Kadono, Yu Nakagama, Yuko Nitahara, Truong Huu Hoang, Le Thi Thanh Thuy, Tsutomu Matsubara, Naoko Ohtani, Kazuo Ikeda, Katsutoshi Yoshizato, Norifumi Kawada.
  • Journal Title: Antioxid Redox Signal. Volume: 38 Pages: 463-479
  • DOI: 10.1089/ars.2021.0279
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cloaking the ACE2 receptor with salivary cationic proteins inhibits SARS-CoV-2 entry (2022)
  • Author(s): Yoshizato Katsutoshi、Taira Toshio、Sato-Matsubara Misako、Sekiguchi Shizuko、Yabunaka Yoriko、Kira Yukimi、Ohashi Tetsu、Daikoku Atsuko、Ofusa Ken、Kadono Chiho、Oikawa Daisuke、Matsubara Tsutomu、Nakagama Yu、Kido Yasutoshi、Tokunaga Fuminori、Ikeda Kazuo、Kaneko Akira、Kawada Norifumi
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 172 Issue: 4 Pages: 205-216
  • DOI: 10.1093/jb/mvac054
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cytoglobin attenuates pancreatic cancer growth via scavenging reactive oxygen species (2022)
  • Author(s): Hoang Dinh Viet、Thuy Le Thi Thanh、Hai Hoang、Hieu Vu Ngoc、Kimura Kenjiro、Oikawa Daisuke、Ikura Yoshihiro、Dat Ninh Quoc、Hoang Truong Huu、Sato-Matsubara Misako、Dong Minh Phuong、Hanh Ngo Vinh、Uchida-Kobayashi Sawako、Tokunaga Fuminori、Kubo Shoji、Ohtani Naoko、Yoshizato Katsutoshi、Kawada Norifumi
  • Journal Title: Oncogenesis Volume: 11 Issue: 1 Pages: 1-13
  • DOI: 10.1038/s41389-022-00389-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Capacity of extracellular globins to reduce liver fibrosis via scavenging reactive oxygen species and promoting MMP-1 secretion. (2022)
  • Author(s): Hieu VN, Thuy LTT, Hai H, Dat NQ, Hoang DV, Hanh NV, Phuong DM, Hoang TH, Sawai H, Shiro Y, Sato-Matsubara M, Oikawa D, Tokunaga F, Yoshizato K, Kawada N.
  • Journal Title: Redox Biol. Volume: 52 Pages: 102286-102286
  • DOI: 10.1016/j.redox.2022.102286
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Non-heat-stressed Method to Isolate Hepatic Stellate Cells From Highly Steatotic Tumor-bearing Liver Using CD49a. (2022)
  • Author(s): Yi Cheng, Ryota Yamagishi, Yoshiki Nonaka, Misako Sato-Matsubara, Norifumi Kawada, Naoko Ohtani
  • Journal Title: Cellular and molecular gastroenterology and hepatology Volume: 14 Issue: 4 Pages: 964-966
  • DOI: 10.1016/j.jcmgh.2022.07.006
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cancer cells produce liver metastasis via gap formation in sinusoidal endothelial cells through proinflammatory paracrine mechanisms. (2022)
  • Author(s): Huu Hoang T, Sato-Matsubara M, Yuasa H, Matsubara T, Thuy LTT, Ikenaga H, Phuong DM, Hanh NV, Hieu VN, Hoang DV, Hai H, Okina Y, Enomoto M, Tamori A, Daikoku A, Urushima H, Ikeda K, Dat NQ, Yasui Y, Shinkawa H, Kubo S, Yamagishi R, Ohtani N, Yoshizato K, Gracia-Sancho J, Kawada N.
  • Journal Title: Sci Adv. Volume: 8(39) Issue: 39 Pages: 5525-5525
  • DOI: 10.1126/sciadv.abo5525
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 6His-tagged Recombinant Human Cytoglobin Deactivates Hepatic Stellate Cells and Inhibits Liver Fibrosis by Scavenging Reactive Oxygen Species (2021)
  • Author(s): Ninh Quoc Dat, Le Thi Thanh Thuy, Vu Ngoc Hieu, Fuminori Tokunaga, Massimo Pinzani, and Norifumi Kawada
  • Journal Title: Hepatology Volume: 0-0 Issue: 6 Pages: 0-0
  • DOI: 10.1002/hep.31752
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Stress can attenuate hepatic lipid accumulation via elevation of hepatic β-muricholic acid levels in mice with nonalcoholic steatohepatitis. (2021)
  • Author(s): Sayuri Takada, Tsutomu Matsubara, Hideki Fujii, Misako Sato-Matsubara, Atsuko Daikoku, Naoshi Odagiri, Yuga Amano-Teranishi, Norifumi Kawada, Kazuo Ikeda
  • Journal Title: Laboratory investigation Volume: 101 Issue: 2 Pages: 193-203
  • DOI: 10.1038/s41374-020-00509-x
  • NAID: 120007147938
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Anti-fibrotic treatments for chronic liver diseases: the present and the future (2021)
  • Author(s): Naoshi Odagiri, Tsutomu Matsubara, Misako Sato-Matsubara, Hideki Fujii, Masaru Enomoto, Norifumi Kawada
  • Journal Title: Clinical and molecular hepatology Volume: - Issue: 3 Pages: 413-424
  • DOI: 10.3350/cmh.2020.0187
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 肝細胞膜による肝星細胞活性化の抑制作用 (2022)
  • Author(s): 井上喜楽々、松原三佐子、松原勤、宇留島隼人、湯浅秀人、大黒敦子、池田一雄、吉里勝利、鈴木孝幸、河田則文
  • Organizer: 第36回肝類洞壁細胞研究会学術集会
• [Presentation] 肝転移におけるがん細胞―肝類洞内皮細胞相互作用の解明 (2022)
  • Author(s): Huu Hoang Truong, 松原三佐子、湯浅秀人、Le thi Thah Thuy, 松原勤、池田一雄、吉里勝利、河田則文
  • Organizer: 第36回肝類洞壁細胞研究会学術集会
• [Presentation] 肝細胞膜による肝星細胞の脱活性化機構の解明 (2022)
  • Author(s): 井上喜来々、松原三佐子、松原勤、宇留島隼人、湯浅秀人、大黒敦子、池田一雄、吉里勝利、河田則文
  • Organizer: 第29回日本門脈圧亢進症学会総会
• [Presentation] 肝細胞と肝星細胞との細胞膜を介した直接的なクロストーク (2022)
  • Author(s): 肝細胞と肝星細胞との細胞膜を介した直接的なクロストーク，井上喜来々、松原三佐子、松原勤、宇留島隼人、湯浅秀人、大黒敦子、池田一雄、吉里勝利、鈴木孝幸、河田則文
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 肝細胞がんにおける肝類洞壁内皮細胞内ギャップ形成の分子機序解析 (2022)
  • Author(s): 松原三佐子、Huu Hoang Truong, 、湯浅秀人、井上喜楽々、松原勤、池田一雄、吉里勝利、河田則文
  • Organizer: 第29回肝細胞研究会
• [Presentation] 肝細胞の肝星細胞活性化抑制作用における肝細胞膜の重要性 (2022)
  • Author(s): 井上喜楽々、松原三佐子、松原勤、宇留島隼人、湯浅秀人、大黒敦子、池田一雄、吉里勝利、鈴木孝幸、河田則文
  • Organizer: 第29回肝細胞研究会
• [Presentation] 肝細胞と肝星細胞との細胞膜を介した直接的なクロストーク (2021)
  • Author(s): 井上喜来々、松原三佐子、Truong Huu Hoang、松原勤、宇留島隼人、湯浅秀人、大黒敦子、池田一雄、吉里勝利、河田則文
  • Organizer: 肝細胞研究会
• [Presentation] 臨床検体から抽出した癌抑制遺伝子SKIによる肝胆癌細胞周期の抑制 (2021)
  • Author(s): 川村悦史、松原勉、大黒敦子、武藤芳美、高田さゆり、新川寛二、木下正彦、小田桐直志、小谷晃平、元山宏行、小塚立蔵、松原三佐子、萩原淳司、藤井英樹、打田佐和子、田中肖吾、竹村茂一、榎本大、田守昭博、久保正二、池田一雄、河田則文
  • Organizer: 第44回 日本肝臓学会西部会
• [Presentation] Cytoglobin欠損マウスの肝星細胞に由来する一酸化窒素は肝細胞のミトコンドリア機能障害を引き起こす (2021)
  • Author(s): 翁良徳、松原三佐子、宇留島隼人、松原勤、池田一雄、吉里勝利、河田則文
  • Organizer: 第35回 肝類洞壁細胞研究会
• [Presentation] Intracellular gap formation of the liver sinusoidal endothelial cells facilitates the liver metastasis ability of cancer cell (2021)
  • Author(s): Truong Huu Hoang, Misako Sato-Matsubara, Yuasa Hideto, Tsutomu Matsubara, Hayato Urushima, Le Thi Thanh Thuy, Atsuko Daikoku, Yoshinori Okina, Akihiro Tamori, Katsutoshi Yoshizato, Norifumi Kawada
  • Organizer: American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting 2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cell membrane-mediated direct crosstalks between hepatocytes and HSCs (2021)
  • Author(s): Kirara Inoue, Misako Sato-Matsubara, Truong Huu Hoang, Tsutomu Matsubara, Hayato Urushima, Atsuko Daikoku, Kazuo Ikeda, Katsutoshi Yoshizato, Norifumi Kawada
  • Organizer: Asian Pacific Association for the Study of the Liver (APASL) Single Topic Conference 2021 Osaka
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Intracellular gap formation of the liver sinusoidal endothelial cells facilitates the liver metastasis ability of cancer cells (2021)
  • Author(s): Truong Huu Hoang, Misako Sato-Matsubara, Yuasa Hideto, Tsutomu Matsubara, Hayato Urushima, Le Thi Thanh Thuy, Atsuko Daikoku, Yoshinori Okina, Akihiro Tamori, Katsutoshi Yoshizato, Norifumi Kawada
  • Organizer: American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) The Liver Meeting 2021
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 大阪公立大学大学院医学研究科肝胆膵病態な化学
  • URL: http://www.med.osaka-cu.ac.jp/liver/