C型肝炎ウイルスおよび新型コロナウイルス複製に必要な膜小胞の形成メカニズムの解析
Project/Area Number |
21K07974
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
Principal Investigator |
相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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Keywords | C型肝炎ウイルス / 新型コロナウイル / doble membrane vesicle / NS5A / サブゲノミックレプリコン / HSD11 / 新型コロナウイルス / プラス鎖RNAウイルス / 複製 / double membrane vesicle |
Outline of Research at the Start |
プラス鎖RNAウイルスはDMVを形成し、その中で複製していることが知られている。本研究の目的は、HCVをモデルとして、DMV形成に関与する宿主因子を見い出し、DMV形成のメカニズムを明らかにすることである。HCVのDMV形成についてはNS5AがDMV形成に必須なことが知られていることから、NS5A膜結合タンパクのHCV複製メカニズムを解明することを目的にしている。本研究はDMVで複製するSARS-CoV-2にも共通な治療の標的となるものと期待できる。閉じた膜系は細胞の生命活動の特徴であり、膜の生物学の研究に新らたな知見を提供できる可能性があり、学術的・実用的両面で価値の高い研究と考えられる。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)をモデルとしてdoble membrane vesicles (DMV)形成に関与する宿主因子を見出し、DMV形成のメカニズムを明らかにすることである。HCVのDMV形成についてはNS5AがDMV形成に必須なことが知られている。そこで、Huh7細胞にサブゲノミックレプリコンを導入し、NS5Aで免疫沈降反応を行なって、プロテオーム解析を行なったところ、NS5A結合タンパクとして11β-Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD11)を見出した。さらに、脂肪滴周辺膜の比較プロテオーム解析からもHSD11を見出し、HSD11がウイルス粒子産生に重要な役割を持つことを示した。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在している。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性を調べている。 SARS-CoV-2に感染したVero細胞及び腸管オルガノイドからRNAおよびDNAを抽出し、qRT-PCR、qPCRを行った結果、RNAとDNAの両方からウイルス遺伝子の増幅が観察された。また、COVID-19罹患後の大腸検体を用いた解析でも、RNAとDNAの両方からランダムに増幅されていることが明らかになり、SARS-CoV-2が逆転写される可能性が示唆されている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究から、HSD11の脂肪滴局在性がHCV粒子産生に重要な役割を果たす可能性が示唆された。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在している。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性を調べるため、HSD13欠損細胞株を作製した。さらに、HSD13の脂肪滴局在シグナル欠損、酵素活性欠損など14種類のプラスミドを作成した。その後、レンチウイルスを用いて、野生型HSD13を含めて、HSD13欠損株に戻した細胞株を作成し、GFPの発現により、レンチウイルスでのHSD13及びそれら変異体の導入を確認した。 SARS-CoV-2を感染させたVero細胞及びから腸管オルガノイドからRNAおよびDNAを抽出し、それぞれqRT-PCR、qPCRを行なったところ、RNAからだけでなくDNAからもN遺伝子の増幅が観察された。さらに、感染Vero細胞からRNA、DNAを抽出し、SARS-CoV-2の全長を網羅的に増幅させる98種類のプライマーを用いて増幅し、イルミナシークエンサーでシークエンスを行なった。得られたリードをヒトゲノムにマッピングし、マップされなかったリードをSARS-CoV-2にマッピングするという手法で解析したところ、RNAではほぼゲノム全長にわたって増幅されており、一方でDNAでもランダムに増幅箇所があることが明らかになった。COVID-19罹患後の大腸検体を用いて同様の解析を行ったところ、増幅箇所に規則性や共通性はないが、RNA、DNAともにランダムに増幅されていることが示された。これらのことはSARS-CoV-2が逆転写されている可能性が示唆される。
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Strategy for Future Research Activity |
HCV粒子形成におけるHSD11の役割として、酵素としての活性、脂肪滴周辺膜への結合タンパクの輸送作用が想定された。さらに、興味深いことに、HSD13は肝臓の線維化に関与していることが報告されている。HSD11またはHSD13欠損細胞を作成し、そこに酵素活性欠損、脂肪滴局在シグナル欠損等の各種HSD11, 13の欠損体を発現させることにより、それぞれの機能がHCVの生活環にどのように関わっているか検討する。 さらに、SARS-CoV-2感染患者組織からRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行なう。今後は逆転写される機序をホストのレトロトランスポゾンに注目して解析する予定である。
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Report
(2 results)
Research Products
(29 results)
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[Journal Article] Interferon-gamma induced APOBEC3B contributes to Merkel cell polyomavirus genome mutagenesis in Merkel cell carcinoma2021
Author(s)
Que L, Li Y, Dainichi T, Kukimoto I, Nishiyama T, Nakano Y, Shima K, Suzuki T, Sato Y, Horike S, Aizaki H, Watashi K, Kato T, Aly HH, Watanabe N, Kabashima K, Wakae K, Muramatsu M.
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Journal Title
J Invest Dermatol
Volume: S0022-202X(21)
Issue: 7
Pages: 02636-1
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Prolonged Gut Dysbiosis and Fecal Excretion of Hepatitis A Virus in Patients Infected with Human Immunodeficiency Virus.2021
Author(s)
Ishizaka A, Koga M, Mizutani T, Lim LA, Adachi E, Ikeuchi K, Ueda R, Aoyagi H, Tanaka S, Kiyono H, Matano T, Aizaki H, Yoshio S, Mita E, Muramatsu M, Kanto T, Tsutsumi T, Yotsuyanagi H
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Journal Title
Viruses.
Volume: 13
Issue: 10
Pages: 2101-2101
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Cellular OCIAD2 protein is a proviral factor for hepatitis C virus replication.2021
Author(s)
Yang Z, Ouyang T, Aoyagi H, Wang T, Xing X, Zhang Y, Wang Y, Li Y, Aizaki H, Li S, Kong L
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Journal Title
Int J Biol Macromol.
Volume: 188
Pages: 147-159
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Presentation] Hepatocellular organellar abnormalities following elimination of hepatitis C virus2022
Author(s)
Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima, Minami Kikuchi, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Ayako Mimata, Yuriko Sakamaki, Shizuko Ichinose, Masamichi Muramatsu, Kenjiro Wake, Masaya Sugiyama, Masashi Mizokami, Takaji Wakita, Hideki Aizaki.
Organizer
28th International Symposium on Hepatitis C Virus, Flaviviruses, and Related Viruses
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Int'l Joint Research
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[Presentation] Development of a community-based intervention system for linkage to care and follow-up for hepatitis virus-positive individuals cooperating with health care providers2021
Author(s)
Minami Kikuchi, Haruyo Aoyagi, Kosho Wakae, Koichi Watashi, Satoru Hattori, Naoto Kawabe, Kentaro Yoshioka, Junko Tanaka, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita, Motoji Sawabe, Hideki Aizaki
Organizer
Global Heapatitis Summit, The 17th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease
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Int'l Joint Research
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[Presentation] Abnormal hepatocellular organelles in patients with sustained virological response2021
Author(s)
Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima Minami Kikuchi, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Takeya Tsutsumi, Kazuya Okushin, Kyoji Moriya, Kazuhiko Koike, Masamichi Muramatsu, Kenjiro Wake, Takaji Wakita, Hideki Aizaki
Organizer
The 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
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Int'l Joint Research
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[Presentation] 新規の作用によりB型肝炎ウイルス感染を阻害する酸化ステロール合成誘導体の同定2021
Author(s)
大嶋美月, 深野顕人, 岩本将士, Frank Stappenbeck, Feng Wang, 鄭シン, 山崎雅子, 若江亨祥, 相崎英樹, 倉持幸司, 村松正道, 脇田隆字, Farhad Parhami, 渡士幸一
Organizer
日本薬学会第141年会
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[Presentation] 自治体と医療関係者が連携した肝炎ウイルスキャリアの動向調査および陽性者のフォローアップシステムによる行動変容の解析2021
Author(s)
菊池みなみ, 川部直人, 青柳東代, 服部悟, 若江亨祥, 渡士幸一, 吉岡健太郎, 佐竹正博, 是永匡昭, 田中純子, 村松正道, 脇田隆字, 沢辺元司, 相崎英樹
Organizer
第57回日本肝臓学会総会
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[Presentation] Identification of an oxysterol derivative that inhibits HBV infection by interrupting NTCP oligomerization2021
Author(s)
Oshima M, Fukano K, Iwamoto M, Stappenbeck F, Wang F, Wakae K, Aizaki H, Kuramochi K, Muramatsu M, Wakita T, Parhami F, Watashi K
Organizer
第68回日本ウイルス学会
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