| Project/Area Number |
21K07996
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
溝口 恵美子 久留米大学, 医学部, 教授 (40782157)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 炎症性腸疾患 / CHI3L1 / ｐ53 / 核内移行 / 上皮異形成 / 上皮細胞 / 大腸癌 / Chitinase 3-like 1 / p53 / 癌抑制蛋白 / アミノ酸核局在配列 |
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| Outline of Research at the Start |
研究代表者らは、Chitinase 3-like1 (CHI3L1)が炎症性腸疾患の上皮に発現誘導され、その異形成・癌化に関与していることを世界で初めて報告している。さらに、前癌病変でCHI3L1が上皮細胞の核内に移行することを確認している。本研究は、早期癌において、核内移行後のCHI3L1によるp53の発現制御機序を解明するため、CHI3L1の核内移行およびP53制御に関わる可能性のある新規蛋白(蛋白X)を同定し、大腸炎関連癌マウスモデルとヒト大腸癌組織でCHI3L1・p53・蛋白Xの発現状態と癌化頻度をステージ毎に検証し、将来的に蛋白Xの発現阻害による早期癌への臨床応用を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
炎症性腸疾患における慢性炎症時に、腸管上皮細胞が異形成の段階を経て早期癌、進行癌を起こす過程で、酵素活性を持たないがキチン質に結合能を有するキチナーゼ３様タンパク１型 (CHI3L1)が深く関与していることが知られている。CHI3L1には、144～174番目のアミノ酸に核内局在にかかわると推測されるシークエンスが存在し、このシークエンス内の最尾部(170～174番目)に推測上の細胞周期にかかわる蛋白であるサイクリンの結合部位が存在し、その近傍に２ヶ所のサイクリンリン依存性キナーゼのリン酸化部位（CDK phosphorylation cites）が存在していることも確認している。
我々のグループは、CRISPR/Cas9法を使って、ヒト大腸癌細胞株であるSW480細胞のCHI3L1蛋白内の170~174番目のアミノ酸を欠失した安定発現細胞株（stable-transfectant cells）を作成して、この細胞をknockout (KO)株と命名した。さらに、このKO細胞に全長のヒトCHI3L1 cDNAを組み込んだpEGFP N1ベクターを導入した安定発現株（W2D11株）とpEGFP N1ベクターのみを導入したmock安定発現株（M3C6株）を作成した。CHI３L１ KO細胞はWT細胞と比較して、Day 3およびDay 4 で細胞増殖率が有意に低い(p<0.01)ことをMTS assayで確認した。また、同じ検査法で、M3C6株とW2D11株の間にも同様な有意差(p<0.01)がみられた。W2D11株では、CHI３L１の発現と反比例してp53の発現は抑制された。
今回、我々は、CHI3L1の核内移行にかかわると考えられる２種類の分子（JUP, urotensin-2）をアミノ酸シークエンスで同定した。さらに、pCDNA3.1(+)ベクター（FLAG-tag）に全長のJUPまたはurotensin-2 cDNAを挿入してCHI3L1-GFPを発現しているHEK293細胞に強制発現させたところ免疫染色およびIP-western blot法の両方でCHI3L1とこれらの蛋白との結合を確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今回、新規にCHI3L1の核内移行にかかわると考えられる２種類の分子 JUP (gamma-catenin)とurotensin-2をアミノ酸シークエンスで同定した。pCDNA3.1(+)ベクター（FLAG-tag）に全長のJUPまたはurotensin-2 cDNAを挿入してこれらの蛋白を予定通り強制発現できたが、HEK293細胞に強制発現させた後のIP-western blot法での確認に予定外に時間を費やしてしまった（約半年間）。しかし、CHI3L1/JUP及びCHI3L1/urotensin-2の結合を同法にて確認することができている。また、ヒトp53の免疫染色での確認に難航したが、適切な１次抗体および２時抗体のタイトレーションの結果、確認できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ヒト炎症性腸疾（クローン病および潰瘍性大腸炎））、慢性炎症からの上皮異形成、上皮内癌 (CIS)、進行大腸癌の症例（各１０例）パラフィン包埋切片を用いた免疫染色法で、CHI３L１, JUP, urotensin-２, p５３の発現を確認する。
この研究と並行して、我々はCHI3L1分子が、腸管上皮だけでなく口腔由来の癌細胞株でも発現していることを発見した。悪性疾患の症例として口腔扁平上皮癌（OSCC, 4例）およびCIS,６例、前癌状態として口腔白板症（29例）のパラフィン包埋組織標本を使用して、CHI3L1 の免疫染色を行なった。その結果、進行癌患者ではCHI3L1が弱いびまん性の細胞質発現を示したのに対し、異形成（85.7%）またはCIS (100%)を発症している口腔白板症患者ではCHI3L1が核内に強く発現していることが判明した。これらの結果は、CHI3L1が慢性炎症状態下で一時的に核内に移行し、前癌状態またはCISへの移行につながっている可能性があることを示唆している。また、本研究成果によりこの発見は2023年7月、国内特許（P2023083882）登録されている。
これらの事実から、口腔内癌だけでなく、大腸上皮異形成および大腸CISでもCHI３L１が上皮細胞の核内に移行している可能性があり、この所見が前癌状態を検出するための信頼性の高いバイオマーカーになり得ると考えられる。動物モデルを使った慢性腸炎からの大腸癌（AOM/DSS モデル）を用いて、上皮異形成時のCHI３L１のダイナミックな核内移行とp５３の発現抑制の機序解明も同時に行っていく予定である。
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