| Project/Area Number |
21K08040
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53020:Cardiology-related
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
西井 明子 (関明子) 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (80408608)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (00349698)
古谷 喜幸 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (10424673)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
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| Keywords | コネキシン45 / iPS細胞由来心筋細胞 / 電気生理学的性質 / ゲノム編集 / ギャップジャンクション |
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| Outline of Research at the Start |
この研究の目的は、申請者が最近報告した若年発症する進行性心臓伝導障害と骨・歯牙異常を特徴とするCx45のアミノ酸変異R75H症例の血液細胞から疾患特異的iPS細胞を作製し、心筋細胞に分化させ、その性質について電気生理学的及び分子生物学的手法を用いて健常者と比較検討すること、分子生物学的手法と生化学的手法を用いて、細胞間接合部のCx45分子の近傍に存在する他のCxやイオンチャネルの発現の変化と、Cx45分子と相互作用する蛋白を同定することである。この研究によって、現在まであまり知られていない出生後の心臓におけるCx45の役割を明らかにし、疾患の遺伝子治療につなげたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
コネキシン45（Cx45）は、胎生期の心臓で最初に発現するCxである。出生後はその発現部位が刺激伝導系に限局し、構成するチャネルの単位電流は、心筋細胞に発現する別のCx、Cx43やCx40よりも小さく、その役割については不明な点が多く、遺伝子異常の報告もなかった。本研究の目的は、我々が最近発見した、家族性の心臓伝導障害と骨・歯牙異常を呈する家族で発見されたCx45R75H変異の機能を調べ、その病態機序を解明し、治療につなげることである。本年度は、昨年度までに樹立した患者3名と健常者複数のiPS細胞の品質評価を実施した。iPS細胞の証左である多分化能を検証するために、多分化能マーカーのOCT4, Tra1-60, SSEA4の発現を、これらのヒトiPS細胞コロニーについて、免疫蛍光染色法により検出したところ、いずれも強い発現がみられた。また、樹立iPS細胞を用いて、内胚葉、中胚葉、外胚葉への分化を試みたところ、内胚葉（FOXA2）、中胚葉（Brachyury）、外胚葉（PAX6）の各マーカータンパク質の発現を免疫蛍光染色により認めた。これらの結果は、樹立したiPS細胞が多分化能を有することを示した。
ゲノム編集法を用い、原因遺伝子を正常遺伝子に置換し、比較対照細胞（isogenic control）を作製するために、昨年までにコネキシン遺伝子の所定の位置でゲノムを切断するためのガイドになるgRNAと切断酵素であるCas9を発現するプラスミドコンストラクトを作成した。これを用いて、今年度までに、① 健常者iPS細胞のコネキシン45遺伝子のノックアウト（11塩基の欠損）iPS細胞、② 患者1名のiPS細胞からコネキシン45のR75H（G224A）変異を修復したiPS細胞を得た。
現在、残り2患者のiPS細胞のコネキシン45のG224A変異の修復を目指して、ゲノム編集実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予定していた患者と健常者のiPS細胞の品質評価とゲノム編集の一部の実験は実施することができた。しかしながら、今年度、大学の別棟に研究室が移動することとなり、培養系の実験をほぼ半年実施できなかったため、今年度中に予定していたゲノム編集実験やiPS心筋細胞の誘導などが大きく遅延した。そのため研究期間を１年間延長することとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、原因遺伝子とされるコネキシン45の遺伝子変異を健常型に修復したコントロールiPS細胞の多分化能等の品質評価を実施する。コネキシン変異を持つ3名の患者のiPS細胞、ゲノム編集した健常型コントロールiPS細胞、健常者由来iPS細胞を心筋細胞へ誘導し、主にMED64システムを用いて、機能の違いを検討する。
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