線維細胞におけるインテグリンを標的とした肺線維症に対する新規抗線維化療法の開発

• Project/Area Number: 21K08181
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 内藤 伸仁 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 特任助教 (10895931)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 肺線維症 / 線維細胞 / インテグリン

Outline of Research at the Start

肺線維症の病態形成において、線維細胞はエフェクター細胞として重要な役割を果たすことが示されている。最近申請者の所属する研究グループは、肺線維細胞の純度がより高い細胞集団を単離する方法を開発し、なかでもコラーゲンを発現する亜集団において、α9インテグリンの発現が亢進していることを見いだした。本研究では、線維細胞におけるα9インテグリンと肺線維症の病態形成との関わりを検討する。本研究の成果は、インテグリンを標的とした線維細胞の機能制御法における新たな基盤を創出し、新規分子標的抗線維化薬の開発につながるものである。

Outline of Annual Research Achievements

線維細胞は肺線維症における重要なエフェクター細胞とされる。最近研究代表者の所属する研究グループは、肺線維細胞の純度がより高い細胞集団を単離する方法を開発し、なかでもコラーゲンを発現する亜集団において、α9インテグリンの発現が亢進していることを見いだした。本研究では、線維細胞におけるα9インテグリンの機能と肺線維症の病態形成との関わりを検討することで、α9を含めたインテグリンシグナルが線維細胞に果たす役割を明らかにすることを目的とする。
本年度は、α9インテグリンシグナルが線維細胞に及ぼす影響について検討することとし、まず分化能に及ぼす影響を評価することを試みた。方法としては、ヒトおよびマウス末梢血由来単核細胞から線維細胞を単離する際に、フィブロネクチンもしくはオステオポンチン（OPN）でコーティングしたディッシュを用いて培養した場合、さらに両者を添加して培養した場合で、ディッシュ上に接着したコラーゲン陽性細胞の比率を求めることで評価することを試みた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

in vitroで線維細胞におけるα9インテグリンの機能解析を行うためのアッセイ系確立に難渋している。具体的には、既知の報告に基づいたマウス末梢血単核細胞から線維細胞への誘導効率が悪いことが問題となっている。そのため、種々の条件下でディッシュ上に接着した線維細胞の比率を求める段階まで到達していない。

Strategy for Future Research Activity

ブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスの肺組織から、研究代表者の所属する研究グループが開発した方法を用いて、肺線維細胞の純度がより高くα9インテグリンの発現が亢進している細胞集団を単離し、線維細胞の機能（液性因子産生能、コラーゲン産生能、線維芽細胞への分化能）を発揮するか解析する。
α9インテグリンとオステオポンチン（OPN）との結合により、線維細胞の機能（分化能、増殖能、遊走能、液性因子産生能、コラーゲン産生能）にどのような影響がもたらされるかについて解析する。いずれも抗α9インテグリン抗体を加えた場合の阻害効果を確認する。研究代表者の所属する研究グループが開発した方法を用いて単離した、肺線維細胞の純度がより高くα9インテグリンの発現が亢進している細胞集団においても、同様の解析を行う。siRNAによる阻害効果も確認する。
抗α9インテグリン抗体を、ブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスに経気管的および経静脈的に投与し、肺線維化への影響をAshcroftスコアやHydroxyprolineアッセイにより評価する。さらにマウス末梢血由来単核細胞からフィブロネクチンおよびOPNでコーティングしたディッシュを用いて単離した線維細胞を同様に移入し、肺線維化への影響を同様に評価する。また、抗α9インテグリン抗体を加えた線維細胞を移入した場合の阻害効果を確認する。さらに、研究代表者の所属する研究グループが開発した方法を用いて単離した、肺線維細胞の純度がより高くα9インテグリンの発現が亢進している細胞でも同様の移入実験を行う。
ヒト肺線維症患者由来の末梢血や気管支肺胞洗浄液から単離した線維細胞において、α9インテグリンの発現をフローサイトメトリーで評価する。肺生検組織検体における発現については、免疫組織染色で評価する。さらに治療の有無における発現の違いについて検討する。