| Project/Area Number |
21K08259
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53040:Nephrology-related
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
中島 由郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30455430)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | ネフロン癆 / 一次線毛 / ANKS6 / リン酸化 / 嚢胞腎 / RNA結合タンパク質 / 尿細管 |
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| Outline of Research at the Start |
ネフロン癆の責任遺伝子産物（NPHP）は、主に細胞内小器官である一次線毛に局在し、一次線毛の欠失や構造・機能異常は腎臓のみならず、多くの組織・器官に異常をもたらす。しかし、一次線毛内でのシグナル伝達と、細胞増殖、細胞極性、細胞分化などへの関与に資する分子機構には未解明な点が多い。本研究では、ネフロン癆発生機序の解明を目的として、 ANKS6のリン酸化部位の同定、同定したANKS6リン酸化部位のうち、嚢胞腎発症抑制に必要十分な部位の検証、リン酸化ANKS6依存的シグナル分子の探索を行う。本研究により、 “一次線毛内からのシグナル伝達機構”に対する分子基盤の確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内小器官である一次線毛の欠失や構造・機能異常は腎臓のみならず、多くの組織・器官に異常をもたらす。ネフロン癆の責任遺伝子産物（NPHP）は、主に一次線毛に局在する。最近、研究代表者はNPHPの一種であるANKS６（NPHP16） のリン酸化がネフロン癆モデルマウスの腎臓で阻害されていることを報告した。ネフロン癆発症機序の解明を目的としてANKS６ のリン酸化の意義を明らかにするために、まずリン酸化されているANKS６のアミノ酸残基を同定することを試みた。 樹立済みのマウス近位尿細管上由来の培養細胞（Dai1細胞）に対して、CRISPR/Cas9 システムを利用してANKS６遺伝子のN末端にPAタグを読み枠が合うようにデザインし、ゲノム編集を行なった。作製したPAタグN末端付加ANKS６ 安定発現細胞株から、タグに対する抗体で免疫沈降を行い、溶出液をSDS-PAGEで分離し、ゲルを銀染色した。その結果、分子量からANKS６と推測されるバンドが銀線色によって検出されたため、その部位のゲルを切り出し、理化学研究所に質量分析を依頼した。質量分析の結果、ANKS６の７３２番目のセリンをリン酸化部位として同定した。現在、ANKS６の７３２番目のセリンをアラニンに置換してリン酸化ができないアミノ酸変異（S７３２A）を導入したES細胞の作製を行なっているが、まだ成功していない。CRISPR/Cas9 システム以外のゲノム編集法についても検討し、アミノ酸変異（S７３２A）を導入したES細胞の作製、およびこの変異体ES細胞を用いてキメラマウスの作製を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
三年目の研究計画は一年目に明らかにしたANKS6のリン酸化部位（S７３２）の生物学的意義を知るためにリン酸化できないアミノ酸変異（S７３２A）を導入して個体レベルで解析を行うことであった。ANKS６遺伝子への変異の導入はCRISPR/Cas9 システムを利用して行う。まずES細胞にS７３２Aのアミノ酸変異を導入し、そのANKS６変異体ES細胞とマウス胚からキメラマウスを作製する。現在、CRISPR/Cas9 システムによるES細胞へのアミノ酸変異導入を試みている段階である。具体的には、CRISPR/Cas9ベクターであるpX459に20mer標的配列に基づくオリゴヌクレオチド（sgRNA合成用）を挿入し、標的DNA切断プラスミドを構築した。次にS７３２A変異を導入するssDNAを合成し、構築した標的DNA切断プラスミドと一緒にES細胞にリポフェクションで遺伝子導入した。薬剤セレクションの結果、ES細胞をピックアップし、そのゲノム配列をDNA配列解析を行った。結果としてES細胞のゲノムDNAに対してCRISPR/Cas9による切断は確認できているが、S７３２A変異の導入に成功したES細胞は得られていない。結論としてANKS6遺伝子の７３２Aのアミノ酸変異を導入したES細胞の樹立に成功していないために研究計画が遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
三年目の研究計画は、一年目に明らかにしたANKS6のリン酸化部位（S７３２）の生物学的意義を知るためにS７３２がリン酸化できないアミノ酸変異（S７３２A）を導入して個体レベルで解析を行うことである。現在、キメラマウスを作製するためにCRISPR/Cas9 システムによるES細胞へのアミノ酸変異導入を試みている段階であるが、S７３２Aのアミノ酸変異を導入したES細胞の樹立に成功していない。細胞に導入するプラスミドとssODNの量を検討するなどしたにも関わらず、部分的な配列の置換には成功しているが、完全な標的アミノ酸変異の導入ができていない。今後の対策としてアミノ酸変異導入にCRISPR/Cas9 システムと異なるゲノム編集法を試していきたい。TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）もCRISPR/Cas9 システムと同様に特定のDNA配列を標的として選択的に切断し、遺伝子の挿入、削除、または置換を行うことができる先進的なゲノム編集ツールの一つである。TALENの利点として標的とするDNA配列に対して高い特異性を示し、オフターゲット効果（非標的領域への影響）が非常に低いことが知られている。このTALENを用いたゲノム編集により、マウスES細胞にANKS6遺伝子のS７３２Aアミノ酸置換を導入する。このS７３２Aアミノ酸置換が導入されたES細胞を用いてキメラマウスを作製する予定である。
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