慢性骨髄性白血病におけるDMR達成率向上の治療戦略の開発

• Project/Area Number: 21K08362
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 近藤 健 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (70333606)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小野澤 真弘 北海道大学, 大学病院, 講師 (70455632)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000); Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 慢性骨髄性白血病 / BCR-ABL1 / チロシンキナーゼ阻害剤 / エピゲノム関連遺伝子 / FRET / 薬剤感受性

Outline of Research at the Start

申請者らは蛍光共鳴エネルギー移動の原理を応用し、慢性骨髄性白血病の分子標的治療におけるex vivoでの薬剤感受性試験を開発した。本手法を用いて診断時点での薬剤感受性試験によりDeep Molecular Response達成が予測出来ることを実証した。本研究では、TKI感受性試験により、診断時TKI低感受性と判定されMR4.5未達成となる臨床上の問題点について、１）薬剤低感受性症例を惹起する遺伝子変異の同定、２）遺伝子変異がもたらすmRNA発現プロファイルの網羅的解析による薬剤感受性を規定する標的分子の同定と機能解析、３）薬剤低感受性を解除、克服する薬剤のスクリーニング、を行う。

Outline of Annual Research Achievements

慢性骨髄性白血病はチロシンキナーゼ阻害剤の有用性が確立した疾患である。チロシンキナーゼ阻害剤での治療により長期的な効果が期待出来、一部の症例では薬剤を中止しても再発が認められないtreatment free remissionが達成できることが確立している。一方、十分な治療効果が得られない症例も存在し、これらの症例対する治療法の開発が求められている。これまでにエピゲノム関連遺伝子の変異がTKIの治療成績に関連することが報告されており、本研究では臨床的に検出されるエピゲノム関連遺伝子の変異に焦点を当てて解析を進めている。
１）ASXL1, DNMT3A遺伝子をテトラサイクリン発現誘導システムのレトロウイルスベクターpRetroX-TetOneに組み込み、野生型、変異型のテトラサイクリン発現誘導ベクターを作成し、TKI感受性CML由来細胞株（K562細胞、KU812細胞）に導入し、テトラサイクリンで発現誘導可能な目的遺伝子を発現する安定形質転換細胞株を樹立した。
２）これらの細胞株を用いて、ドキシサイクリン有無でのTKI感受性の解析を行ったところ変異型ASXL1または変異型DNMT3Aの誘導においてTKI感受性の低下が確認された。
３）これらの細胞を用いて、導入遺伝子の発現誘導の有無により発現変動が生じる遺伝子群をマイクロアレイを用いて薬剤感受性細胞と薬剤抵抗性細胞の遺伝子プロファイルを解析し、細胞表面分子や細胞内シグナル分子などの発現変動を確認した。マイクロアレイの結果に基づき、薬剤耐性に関与する候補遺伝子を探索したところ、既報における白血病との関連や薬剤感受性に影響する複数の候補遺伝子が同定された。これらの一部ではRQ-PCRにより実際に発現の変動があることが確認できた。
４）現在、候補遺伝子についてのTKI感受性の観点から機能解析を実施している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年までは候補遺伝子を絞り込めていなかったが、この一年間で候補遺伝子の同定ができた。候補遺伝子が変異型エピゲノム関連遺伝子により発現誘導されること、候補遺伝子産物の阻害剤を併用することで、低下したTKI感受性を解除できることが確認できた。

Strategy for Future Research Activity

今後、候補遺伝子の機能解析を進め、TKI抵抗性細胞においてTKIと候補遺伝子阻害剤の併用治療効果をin vtroおよびマウスへのTKI抵抗性細胞移植実験で検証する。候補遺伝子産物の阻害が治療標的となることを証明する。