Significance of genomic diversity of NOX2 complex in onset and pathogenesis of systemic lupus erythematosus

• Project/Area Number: 21K08470
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 54020:Connective tissue disease and allergy-related
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 川崎 綾 筑波大学, 医学医療系, 助教 (30532816)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 肇 帝京大学, 医学部, 教授 (60585074)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 全身性エリテマトーデス / NCF1 / 疾患感受性遺伝子 / SNV / NOX2複合体 / 遺伝子

Outline of Research at the Start

本研究では、NCF1をはじめとする活性酸素の産生に関わるNOX2複合体を構成する遺伝子群の全身性エリテマトーデス(SLE)発症への寄与を包括的に調べる。シークエンス解析によりNOX2複合体構成遺伝子群のDNA配列情報を取得後、検出されたNOX2複合体遺伝子バリアントとSLEの関連を解析し、SLE発症と関連する疾患感受性バリアントを同定する。さらに、SLE感受性バリアントの機能解析を行い、NOX2複合体遺伝子バリアントがSLE発症を誘導する分子機構を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

全身性エリテマトーデス(SLE)の疾患感受性遺伝子であるNCF1遺伝子には相同性が非常に高い偽遺伝子(NCF1B、NCF1C)が存在するため、NCF1遺伝子領域の解析は非常に困難となっている。SLE感受性バリアントとしてNCF1 Arg90Hisが同定されているが、NCF1遺伝子とSLEの関連はまだ十分解析されておらず、新たな疾患感受性バリアントが存在する可能性が考えられる。本研究では、①正確なNCF1遺伝子配列の決定を目的としたロングリードシークエンス解析、②SLE感受性NCF1バリアントの同定を目的としたショートリードシークエンス解析を行っている。①ではNCF1と偽遺伝子を共通のプライマーで増幅後にPacBio社Sequelシステムにてロングリードシークエンス解析を行った。遺伝子間の相同性が99%以上と非常に高いため、各遺伝子のリードを区別することが難しく現在も条件検討を継続している。②においてはNCF1特異的サイトにプライマーを設定し、NCF1遺伝子全長を２つのフラグメントに分けて増幅した。その後イルミナ社MiSeqにてシークエンス解析を実施した。得られたリードをヒトゲノムリファレンス配列 hg38にマッピングしバリアントの検出を行った。24検体の解析において100箇所以上のNCF1バリアントが検出された。予備検討においてMiSeq を用いたNCF1遺伝子解析が可能であることが確認できたので、次年度はSLEおよび健常者のサンプルを用いてシークエンス解析を実施し、SLE疾患感受性バリアントの同定を試みる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

MiSeq解析において、PCRにてNCF1遺伝子を増幅後に、酵素処理による断片化、ライブラリー調整を行ったが、ライブラリーサイズを目的とするフラグメント長に揃えることが難しく、断片化条件の検討、ライブラリー調整試薬の選択に時間を要した。そのため多数サンプルの解析、その後の関連解析まで至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

引き続きロングリードシークエンス解析にて、NCF1および偽遺伝子の配列決定とNCF1特異的部位の特定を試みる。さらにロングリード、ショートリードシークエンス解析により得られたバリアントデータを比較することにより、シークエンスデータの妥当性を評価する。ショートリードシークエンス解析においては、SLE 192例、健常対照者192例の解析を行い、検出されたNCF1バリアントについて関連解析を実施する。有意な関連が認められたバリアントについては、サンプル数を増やしてreplication studyを実施し関連の確認を行う。
NCF1とともにNOX2複合体を形成するNCF2, NCF4遺伝子のバリアントを対象に関連研究を実施し、NOX2複合体構成遺伝子とSLEの関連を包括的に解析する。

Research Products

• [Journal Article] Genetic dissection of HLA-DRB1*15:01 and XL9 region variants in Japanese patients with systemic lupus erythematosus: Primary role for HLA-DRB1*15:01 (2023)
  • Author(s): Aya Kawasaki, Premita Ari Kusumawati, Yuka Kawamura, Yuya Kondo, Makio Kusaoi, Hirofumi Amano, Yasuyoshi Kusanagi, Kenji Itoh, Takashi Fujimoto, Naoto Tamura, Hiroshi Hashimoto, Isao Matsumoto, Takayuki Sumida, Naoyuki Tsuchiya
  • Journal Title: medRxiv Volume: －
  • DOI: 10.1101/2023.04.05.23288103
  • Open Access
• [Presentation] 全身性エリテマトーデスにおけるXL9領域バリアントの関連解析およびHLA-DRB1との独立性の検討 (2022)
  • Author(s): 川崎綾, 近藤裕也, 藤本隆, 草生真規雄, 天野浩文, 田村直人, 草薙恭圭, 伊藤健司, 松本功, 住田孝之, 土屋尚之
  • Organizer: 日本人類遺伝学会第67回大会
• [Presentation] 日本人集団におけるXL9領域バリアントおよびHLA-DRB1*15:01と全身性エリテマトーデスの関連解析 (2022)
  • Author(s): 川崎綾, 近藤裕也, 藤本隆, 松本功, 草生真規雄, 天野浩文, 田村直人, 草薙恭圭, 伊藤健司, 住田孝之, 土屋尚之
  • Organizer: 第66回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Remarks] 筑波大学医学医療系 分子遺伝疫学研究室
  • URL: https://www.md.tsukuba.ac.jp/community-med/publicmd/GE/